CHAPTER4,愈伤组织培养.

第4章愈伤组织培养定义:指将外植体接种到培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。愈伤组织培养(callusculture)从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期分裂期分化期第一节愈伤组织的诱导和分化一．愈伤组织的诱导诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。组织培养中的脱分化和愈伤组织的形成脱分化：从分化状态（细胞分裂已停止）转变为具有分裂能力的分生状态细胞并形成未（脱）分化的愈伤组织的过程。愈伤组织的形成过程愈伤形成大致分为三个时期（1）起动脱分化时期：即诱导期(起动期)，诱导期是细胞正在准备分裂的时期。细胞改变了原有的代谢方式,合成代谢加强,迅速进行蛋白质和核酸的合成,为细胞分裂做准备.细胞质增加，出现活跃的原生质流动，贮藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积；但细胞大小无多大变化。生长的诱导:植物的组织、细胞离体培养时，如果给予一定的条件，使已分化成熟（停止分裂）的细胞重新分裂，增殖生长.影响愈伤组织诱导的因素植物种类、生理状况、外部因素不同，诱导期不同。弱光下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂二氧化碳抑制诱导分化生长调节剂诱导细胞开始分裂损伤剌激能加速脱分化进行，有时还是某些材料能否脱分化的决定条件。菊芋刚收获块茎22hr贮藏5个月2天胡萝卜几天弱光下的植物比强光下的植物易诱导(离体培养前暗处理)脱分化难易因物种、器官及其生理状态而异，烟草、胡萝卜易，禾谷类难，花器官易，茎叶难，幼嫩组织易，成熟老组织难。（2）分裂期：已具一定功能和结构的分化和成熟的细胞回复到具分裂能力的分生状态.细胞分裂的结果标志着脱分化的完成。分生状态:细胞变小、细胞质稠密、液泡变小、核和核仁变大并趋向细胞中央分化脱分化1、分裂前细胞核的位置必定在萌发孔对面紧靠胞壁在花粉粒中无确定的位置2、分裂前、中的细胞质除一部分靠胞壁外，大部分集中在核对着萌发孔的一侧在核的周围分布比较均匀3、纺缍体纺缍体不对称，近壁端钝，游离端尖，后期向末端转化阶段，纺缍体轴向发生变化分裂过程中纺缍体对称4、新细胞壁分裂后形成的细胞壁呈孤形，位于正对萌发孔新细胞壁平直，与萌发孔没有特定的位置关系5、子细胞具特定的位置、形态和功能两个子细胞不具特定的形态和功能花粉分化的第一次有丝分裂是在有极性的状态下进行的分裂，而脱分化是在失去极性的状态下进行的分裂小麦花粉分化和脱分化第一次有丝分裂的差异陆文樑（1982）脱分化后的愈伤组织其薄壁细胞是非匀质的:愈伤组织虽然未分化出其它特化组织（如维管束等），其薄壁细胞在组成上仍是有差异的在脱分化过程中，伴随着细胞形态结构的变化通过脱分化形成的愈伤组织在培养过程中保持具分生能力的薄壁细胞或肉眼观察不出的分化程度较低的状态（内部已形成一定的形态组织或细胞），因此习惯上称愈伤组织是处在“没有分化”、“脱分化”状态的细胞培养组织的生理生化特性也有变化，原有组织的一些特殊代谢产物（如生物碱或其它次生物质）减少，消失或代之以另外一些前体或结构不同的类似物例如:甜菜根一般不形成淀粉，但离体培养时细胞中有相当多的淀粉形成。分裂期：起动后的细胞进行活跃的细胞分裂.1．细胞的数目迅速增加（外层先开始旺盛分裂）。胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。2．每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。3．细胞形态改变：体积小，成多边型，质浓，液泡小或无，如同根尖和茎尖的分生组织细胞一样。细胞的核和核仁增大到最大。5．细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。6．随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。小愈伤颗粒细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。（3）愈伤组织形成期：愈伤进一步发育，其周缘近表面部分细胞分裂较多，（垂周分裂）形成愈伤形成层，而愈伤深层细胞显著增大，细胞质变稀薄，液泡变大，核和核仁变小并移到细胞边缘，RNA含量下降，在外植体切口处明显可见一团团有一定生长型式的愈伤组织。三个发育时期各有其主要特征，但并不专一，有时会交叉混杂发生。形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。愈伤组织表层与近表层的明显界线外植体外层细胞发生分裂;分裂期的愈伤组织的特征:细胞分裂快,结构疏松,缺少组织的结构,颜色浅而透明.wherethecallus(c)arisesfrom二、愈伤组织内部的组织分化分化期:停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化而形成不同形态和功能的细胞.最明显特征:细胞体积不再减小,保持相对不变化.进入分化期后，细胞的平均大小相对稳定，细胞分裂由原来分裂局限在组织外缘的垂周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，并改变分裂面的方向,出现瘤状结构的外表和内部分化,结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。成熟的愈伤组织，由薄壁细胞组成，但由于它们在发育上的可塑性，在培养过程中，其内部出现一些特化的细胞和有结构类型的组织（如石细胞、色素细胞、维管组织），尚有分生细胞团或分生结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。这些细胞团或细胞分生结节与芽原基，根原基的发生有密切的联系(1)分生组织结节（瘤状、片状）;(2)维管组织结节；12A细胞分裂部位和方向发生改变：B形成瘤状或片状的分生组织结节。或维管组织结节。C细胞的体积相对稳定，不再减少。D出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。E生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。分化期细胞特点：Friable易碎Hard/lignifiedcallusRhizogeniccallus生根的愈伤Callusexudingstickypoly-saccharides渗出粘性多糖的愈伤根据愈伤质地划分为：愈伤组织的继代愈伤组织诱导并生长一段时期后，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养（营养、水分的耗失和代谢产物积累的毒害）。合适时间：愈伤生长即将达到顶峰以前，这时处于旺盛分裂时，继代后容易生长，继代间隔一般四周，继代后3-7天恢复生长，2-3周内旺盛生长，达到顶峰后缓慢下来。大小：直径5-10mm，100mg±，太小难以恢复或生长缓慢。方法：切割成小块转移到新鲜的相同成分培养基上，同时达到繁殖目的，淘汰褐化和坏死的愈伤组织。生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。§2愈伤组织的形态建成一、愈伤组织的形态建成外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。魔芋胚状体小麦愈伤组织再分化(redifferentiation)：是指脱分化形成的愈伤组织在适宜的培养条件下又分化为胚状体，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的过程。愈伤组织的形态发生方式:不定芽方式胚状体方式植物体分离外植体脱分化愈伤组织再分化胚状体根,芽脱分化:是指在人工培养基上外植体经过多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程。再分化:是指脱分化形成的愈伤组织在适宜的培养条件下又分化为胚状体，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的过程。植株细胞再分化的类型（一）器官发生:离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽。1、发生方式：（1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。外植体脱分化愈伤组织(类分生组织)器官原基根、芽2、特征（1）单极性（2）器官的维管与愈伤（外植体)相通3、器官发生顺序（1）先生根后生芽的方式如颠茄的悬浮培养物，还有根易分化芽难分化的如棉花、苦瓜及许多木本植物，组培中最常见的再生器官类型是根的形成，水稻、玉米、油菜、棉花、烟草、蜀葵等的愈伤很易形成根。（2）先生芽后生根的方式如小麦，一般形成的芽其基部很易形成根，而如先形成根，则往往抑制芽的形成。(多见)（3）在愈伤组织上独立生出芽和根的方式(少见)（4）仅有根和芽的分别再生，形成无芽的根或无根的苗愈伤组织芽分化再生苗小麦的形态发生试管苗其它器官发生方式：用组织培养进行花器官形成的研究，用烟草的茎切段作培养物时，可以直接分化形成花芽，用油菜的花茎切段及花器官培养也可见到形成花芽，把这种离体形成的花芽中的花药进行培养时，可得花粉胚状体。在组织培养中，还有变态器官形成,如鳞茎、球茎、块茎等。外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)不定芽方式（adventitiousbud）（二）体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis):离体培养的植物体细胞经诱导分化，形成类似于有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成胚胎状结构，最后产生新植株的过程。胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。反足细胞极核助细胞卵细胞子叶胚芽胚柄胚根含成熟胚的种子再生植株返回合子原胚顶细胞基细胞球形期心形期鱼雷形期子叶期不对等分裂在正常情况下，精卵结合形成合子，进行分裂发育成胚——胚胎发生。组织和细胞离体培养形成在形态、结构和功能上类似有性胚的结构被称为体细胞胚。胚的发育BCDFGHEACitrusclementinaHort.exTan.microspore-derivedembryoidinductionandregeneration(克里曼丁橘)TheembryogenichaploidcalliweremultipliedonMSmediumsupplementedwith5%sucrose,0.02mg/lNAAand0.8%agar.Eleutherococcussenticosus刺五加MassproductionofE.senticosusplantletsviaembryogeniccallusculture.A,Friableembryogeniccallus(arrow)formedneartheradicalportionofprimarysomaticembryosonMSmediumwith4.5mM2,4-Dafter2monthsofculture.Bar=700mm.B,Numerousglobularsomaticembryosformedfromembryogeniccallusaftertransfertomediumlacking2,4-Dafter3weeksofculture.Bar=700mm.C,Clustersofcotyledonarysomaticembryosafter6weeks.Bar=700mm.D,Numeroussomaticembryosformedfromembryogeniccallus.Bar=3mm.E,Individuallyseparatedcotyledonarysomaticembryosformedfromagarmedium;notewelldevelopedcotyledons.Bar=3mm.F,Germinatingsomaticembryosfromembryocluster