CE分离条件的优化方法

毛细管电泳分离条件选择策略概述毛细管电泳分离条件选择的内容很多，且与样品、分离模式、检测方式、进样方法乃至仪器系统结构等相关，但有许多共同之处，这里将对普遍性的问题进行考察，包括毛细管电泳模式选定、仪器操作条件确定、介质选择等。毛细管电泳模式的选定毛细管电泳有许多不同的模式，因而在分离样品前必需很好选择分离模式，以达到最佳的分离结果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普适性、选择性、样品特异性等。毛细管电泳模式的选定以简单性为原则时，所选分离模式的操作、条件优化、分离控制等必需是最简单和最容易的，而且富于后续变化。根据这一道理，首先应该考虑自由溶液分离模式，最后才考虑填充形式的分离模式。简单性原则是毛细管电泳模式选择的一般规则。毛细管电泳模式的选定在分离生物样品时，通常需要根据分离的目的来选择分离模式：欲测定样品的尺寸，就须选NGCE或CGE，偶可选用CZE或MEKC；要测定样品的等电点，则应选用CIEF；在进行亲和作用研究时，则应当首先选用ACE。毛细管电泳模式的选定我们的分析目的可能并不是单一的，这时的分离模式选择，就应该注意考虑其通用性。CZE、MEKC和CEC的通用性和可调节性都较大，但根据简单性原则，还以CZE或MEKC为优。注意，填充型毛细管电泳不适合于颗粒样品的分离，甚至也不适合于大分子分离。毛细管电泳模式的选定有时，我们会特别注重分离的选择性，即只希望把目标组分分离出来。此时应优先考虑选择性高的分离模式，如ACE等。如果已知样品的某些特性，也可以据此选择分离模式，比如在分离蛋白质和多肽等两性样品时，可以优先考虑CIEF；在分离中性分子时，优先考虑MEKC；在分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式等。毛细管电泳模式的选定实际样品五花八门，性质各异，分离模式的选择是可变的和灵活的。这种灵活性恰好与毛细管电泳模式间的易换性相吻合。基本操作条件选择这里所谓的操作条件包括：电泳电压、温度、毛细管尺寸、进样方法、检测条件等，下面分别讨论之。电泳电压理论和实验均表明，效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，则极大电压可能会超出仪器的控制范围，此时没有最佳电压，可选用仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压有可能很小，若此时的分离度很高，也可以选择大于极大值的电压进行分离。电泳电压极大电压可以利用理论计算或实验测定来获得。利用理论效率方程，通过求极值的方法可以确定极大电压。理论计算过程往往繁琐，而且也不很可靠，通过实验测定来确定工作电压其实非常简单。根据欧姆定律，电流和电压具有线性关系，如能测定电压与电流的关系曲线就不难确定工作电压。电泳电压方法如下：①在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）；②做电压～电流曲线；③取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150～400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。电泳电压除工作电压选择外，还应考虑电压施加方式的选择。理论上，毛细电泳可有恒流、恒压、恒功率、梯度升（降）压分离等不同的工作方式。目前，绝大多数分离采用瞬间升压的恒压工作方式。实际上，采用恒流工作方式有利于提高分离的重现性，在没有良好恒温控制的系统上进行电泳时，建议采用恒流或恒功率操作。经验表明，采用升压（升流）分离，可以有效提高分离度，有条件时，应当充分考虑线性升压的工作方式。在微量制备研究中，还需要考虑降压分离过程，以便于馏分的准确收集。电泳温度电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制旨在避免管内溶液因过热而出气泡或沸腾，显然温度越低越好；重现性控制意在避免温度波动；分离效率控制的目的在于提高分离度，依据样品性质的变化而高低不等，需由实验来测定。此外，某些介质对工作温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。电泳温度多数情况下，在20～30℃之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。如若不然，便需调整或优化温度。优化多从室温开始，向上搜寻，若无结果，再向下搜寻。不少糖类样品需要高于室温的分离环境，有些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。电泳温度毛细管电泳温度的选择，目前还受到仪器条件的限制，大多数商品仪器只能在20～50℃之间进行选择，而且不能实现温度梯度控制。此方面的研究还有待进一步展开。电聚焦当离子从高电场突然进入低电场时，会因减速而堆集在电场交界处，导致区带缩短、浓度提高，进而提高检测灵敏度和分离效率。电场聚焦进样需要至少一个台阶电场梯度。利用温度梯度、粘度变化（CGE）、电解质浓度梯度等方法都能构建出电场梯度，其中电解质浓度梯度法最简便实用，可分简单电聚焦、增强电聚焦和整管进样聚焦等方法。简单电场聚焦设样品中的电解质浓度比电泳缓冲液低得多，则在进行电动进样时，电场就会基本加在样品与管口之间，而很少加在毛细管中。如此，样品就会快速迁移到管口并突然减速堆积。仅需把样品配制在低浓度缓冲液或纯水中就能降低样品中的电解质浓度。此法可提高检测灵敏度2～10倍。用水配制样品，由压力进样，也可在电泳初期产生聚焦现象，但聚焦时间很短，检测灵敏度的提高有限（不大于2倍）。增强电场聚焦利用压力法先进一段水区带，然后用电迁移法正常进样，可以增强聚焦效果。纯水区带的电导趋于零，在电动进样期间将承受所有的电场，而管内其他部位电场趋于零。在此情形下，不产生电渗（不满足电渗产生的第一个条件），仅一种符号的离子（取决于电场方向）可迁入管中并迅速穿过水区带、浓集于它的前沿。如想同时分离异号离子，则需用正负电场顺序进样各一次。增强电场聚焦本进样法成功的关键在于水区带和样品区带长度比的控制，一般需通过实验来优化。研究表明，水区带最好不要长于2mm，电迁移进样时间应控制在1min以内。在优化条件下，本法可提高检测灵敏度102～103倍而不损失分离效率。一种简化的方法是：用压力法顺序引入水、样品和电泳缓冲液区带，然后加电压分离。在分离初期，正负离子各自聚焦在水区带的前沿和后沿。本方法可提高检测灵敏度一倍以上。整管进样如果样品溶液过稀，则可将其灌满整根毛细管，并施加反向分离电压至电流上升到正常值的95%，然后改变电压方向进行正常电泳分离。其机制是：在反向电压下，电渗将电泳缓冲液从毛细管的（正常）出口泵入并引起此部位电场突降，这时，逆电渗而动的离子，在逾越突降面时就会减速、堆积，同时又被快速的电渗推回。这种过程连续不断地进行，直至缓冲液到达进口时才被强行停止。本聚焦方法具有方向性，如毛细管产生从正到负的电渗，只浓集负离子，若产生从负到正的电渗则浓集正离子。pH聚焦本法适用于弱解离样品，尤其适用于两性样品。这类样品在经过pH突变界面时，会因解离度变化而发生迁移速度乃至迁移方向突变，产生堆积现象。设电渗流向负极，我们从正极进样且样品区带的pH高于背景，则酸性样品会高速向后迁移并在区带后沿减速和集结，而碱性样品则向前加速，不能聚焦。如果样品区带pH低于背景，则酸性样品不聚焦而碱性样品向前减速，集结于区带前沿。pH聚焦对于两性组分，设样品区带pH＞pI而背景pH＞pI，则组分在区带中为负离子，它们向后（正极）迁移，进入背景后又变成正离子，再往回（负极）迁移，如此往复，紧密聚焦在区带后沿。若样品区带为低pH而背景为高pH，则样品离子向前迁移，聚结在区带前沿。凡向后聚焦的操作，最好在进样后，跟着再进一段背景缓冲液，以免区带跑出管口。利用pH聚焦可使两性组分的检测灵敏度提高两个数量级以上而效率保持不变。色谱浓集利用色谱原理让样品先在柱头吸着，而后进行在线洗脱分离，可以大幅度提高毛细管电泳的进样体积（至微升级）。有三类在线柱头浓集方法：①涂层法，即在进样端键合一段色谱固定相，此法流动阻力小、易于操作，但浓缩量有限；②填充法，即在管头填充色谱填料，其优劣与①相反，注意，一旦填充处被堵，就需切去重装；③拼接法，即将填充好的色谱小柱拼接到毛细管头上，本法可使进样量达到10µl以上。拼接法亦有多种，建议将色谱填料充填在内径等于分离管外径的塑料管中，这样只须将分离管插入填好的小柱中即可，能随时更换。检测条件一般地，检测条件的选择包括检测方法、检测方式及有关参数选择等。毛细管电泳可以有柱上和柱后两种检测方式，除与质谱和核磁联用外，商品仪器通常采用柱上检测方式，没有多少选择的余地，所以检测方式的选择主要是针对自己组装的毛细管电泳系统。光吸收或发射型检测手段，通常采用柱上检测方式；电化学等检测手段，宜采用柱后检测方式。检测条件毛细管电泳检测方法的选择也比较有限，商品仪器中通常只有紫外吸收检测方法，有些厂家如Beckman与Agilent等出口的仪器还配有激光诱导荧光检测器，也可以和质谱联用。由于激光诱导荧光具有极高的检测灵敏度，所以只要有条件，就应当尽量选用它。不过，激光诱导荧光检测系统比较昂贵，而且通常需要对样品进行衍生方能实现检测，所以大家还是普遍采用紫外检测方法。检测条件紫外吸收是一种相当成熟和可靠的检测方法，有单波长、多波长、可变波长和波长扫描或二极管阵列等不同形式的检测设计，它们各有优劣：二极管阵列或波长扫描可以测定分离峰的紫外吸收光谱，用于组分定性和纯度鉴定，但检测灵敏度相对较低；可变波长检测器，能提供各种不同的波长，以获得选择性检测，但检测光线的能量一般较弱，灵敏度居中；多波长或单波长仅能提供有限的波长，但检测灵敏度高。检测条件在多数毛细管电泳中，使用200nm或205nm附近的检测波长，能对绝大多数的样品提供高灵敏度的检测条件。如果毛细管中填有凝胶，则检测波长需选在210nm以上，否则会因背景太强而测不出峰。紫外波长选择参数可参见表27,P64。分离介质选择分离介质的选择包括缓冲试剂、添加剂、溶剂、pH、试剂浓度、筛分介质、分配相等的选择与优化。这些参数的优化与分离模式有关。现以CZE介质的选择为重点进行介绍，在此基础上扩充介绍其他各模式介质的选择。毛细管区带电泳介质选择毛细管区带电泳是CE中最基本的方式，其介质的选择与控制也是其他分离模式的基础。毛细管区带电泳介质实际上是一种具有pH缓冲能力的均匀的自由溶液，通常称为电泳缓冲液（Runningbuffer）,简称缓冲液（Buffer）,由缓冲试剂、pH调节剂、溶剂和添加剂组成。缓冲液的选择，可分为pH与缓冲试剂选择、添加剂选择等部分。pH及其缓冲试剂缓冲体系由缓冲试剂和pH调节剂两部分构成，其中缓冲试剂的选择主要由所需的pH决定，而pH则依样品的性质和分离效率而定。PH的选择是决定分离成败的一大关键。若样品的解离常数已知，可用公式进行计算，使组分间µem差别最大时所对应的pH就是理论最佳pHm。凡pKa=pHm±1、µem与样品接近、无紫外吸收的化合物均可视为候选缓冲试剂。对候选缓冲试剂进行实验测定，通常就能选出最佳试剂。pH及其缓冲试剂计算方法显然很吸引人，但实际样品的解离常数大多未知，做不了计算。此外，pH除控制弱电解质样品的有效淌度外，还控制着电渗甚至样品在管壁上的吸附水平，这就难以计算了。如此，就必需通过实验的搜寻和优化来选择最佳pH。可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。毛细管电泳中常用的缓冲体系还有硼酸或硼砂等，详见表28，P65。pH及其缓冲试剂研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离