CYP450工作开展计划

CYP450工作开展计划一、菘蓝细胞色素P450的基因组学分析1.菘蓝P450基因的鉴定从NCBI和P450数据库下载其他植物如拟南芥、水稻、番茄等已报道的P450基因数据。根据植物P450基因的分类原则,每个亚家族选择代表性的P450蛋白质序列与菘蓝基因组数据进行BLASTN比对。参照国际上关于P450命名的权威数据对菘蓝中的P450基因进行命名。2.菘蓝P450系统进化树的构建通过MUSCLE对所鉴定的P450氨基酸序列比对,利用MEGA5.2软件测试菘蓝P450基因的氨基酸序列构建系统发育树的最佳模型,根据最佳模型,分别采用MEGA5.2软件中最大似然法)和mr-bayes软件贝叶斯法构建系统进化树。3.多序列比对及二级结构元件分析对预测的P450蛋白序列每个家族选择代表性成员使用ClustalX(1.83)软件进行多序列比对。将已知的拟南芥AtAOS(CYP74)序列结构作为基础,与预测的烟草P450代表性序列进行多序列比对。并以AtAOS的二级结构作为模板标明二级结构元件。4.菘蓝P450基因表达谱分析利用Cluster3.0进行层次聚类分析,Treeview软件对数据结果进行可视化。使用RNA快速提取试剂盒提取菘蓝不同时期各器官的RNA。并使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,进行RT-PCR分析。二、菘蓝靛蓝合成候选CYP450基因克隆及表达模式分析1.候选基因的筛选分析不同诱导子处理下菘蓝中CYP基因家族成员的表达变化，与HPLC法测定的相同条件下菘蓝中靛蓝含量比较，筛选与靛蓝合成密切相关的CYP基因作为候选基因。2.候选CYP450基因及启动子区的克隆采用Primer5.0软件设计引物在gDNA和cDNA水平上进行PCR和RT-PCR，获得该基因的DNA全长和开放阅读框（ORF）。在全长序列的基础上设计引物GSP1、GSP2、GSP3和GSP4，联合接头引物AP1和AP2，通过BDGenomeWalker获得5’启动子区。3.候选基因序列和蛋白的生物信息学分析4.用BLAST和DNAStar寻找ORF并翻译。通过GSDS在线工具分析候选基因结构。采用ExPASy-ProtParam分析蛋白质的理化性质；ExPASy-ProtScale分析蛋白质的亲疏水性；TMHMM分析蛋白质的跨膜结构域；SOPMA分析蛋白质的二级结构；SWISS-MODEL分析蛋白质的三维立体结构；TargetP和NucPred分析蛋白质的亚细胞定位。运用PlantProm-TSSP和PlantCARE分析启动子区的顺式作用元件以及预测转录起始位点。通过MEGA4.0邻接法构建系统树。5.候选基因表达模式分析qPCR分析候选基因在不同部位和不同诱导条件下的表达。6.候选基因在靛蓝合成过程中的功能验证构建CYP基因的干涉和过表达载体，并对菘蓝进行转化。7.候选基因编码蛋白细胞色素P450单加氧酶活性检测将含候选基因的载体质粒转入大肠杆菌，检测其是否具有细胞色素P450单加氧酶活性。