DNA分子遗传标记技术在生药鉴定中的应用

DNA分子遗传标记技术在生药鉴定中的应用摘要：概述了中药鉴定中应用的DNA分子遗传标记技术(也称DNA分子遗传诊断技术)，就近些年利用DNA分子遗传标记技术对中药进行鉴定的最新进展进行综述。展望了DNA分予遗传标记鉴别在生药鉴定中的前景。关键词：DNA分子遗传标记技术生药鉴定前言：我国药材资源丰富，据统计有1～2万余种，其中药用植物大约有10000多种(包括中药约600种)，它们是我国人民防病治病的重要资源，同时也是寻找和开发新药的宝库[1]。药用植物是传统中药的重要来源，其研究必须现代化才能满足新药开发的需要，为确保中药使用安全、有效，对各种药材进行准确地鉴定显得十分重要。传统的鉴定方法有:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定。然而，这些鉴定方法均为生物体遗传表现性的鉴别，它们不仅受到遗传因素的影响，而且与生长发育阶段、环境条件、人类活动(如引种驯化、加工炮制等)有着密切关系，具有很大的变异性和可塑性。随着现代分子生物学技术的迅猛发展，分子生物学和基因工程技术日臻成熟，用DNA分子遗传标记技术对中药材进行鉴定具有不受环境因素、个体发育阶段及组织部位的影响，多态性强，准确率高等特点，展示了良好的应用前景[2]。DNA分子遗传标记(DNAMolecularGeneticMarker)技术在基因定位、品种鉴定、资源评价、物种亲缘关系和系统演化等个方面取得了很大进展。现从几个方面探讨它们在药用植物研究上的应用。1.DNA分子遗传标记技术DNA分子遗传标记技术(也称DNA分子遗传诊断技术)是指通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA多态性，通过直接诊断分析DNA的多态性，便能避开遗传特性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快速准确地鉴定药材真伪[3]。1.1Southern杂交为基础的DNA分子标记技术限制性内切酶切片断长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)，单链构象多态性RFLP(SingleStrandConformationPolymorphism-RFLP,SSCP-RFLP)等。这一类技术的共同点是利用一种或几种限制性内切酶消化不同生物个体的DNA分子，再通过特异性的克隆或合成的探针进行分子杂交来揭示其DNA的多态性。1.2PCR为基础的分子标记技术随机扩增多态性DNA(RandomAmplifedPolymorphicDNA,RAPD)，标记位点测序(SequenceTaggedSite,STS)，随机引物PCR(RandomPrimer-PolymeraseChainReaction,RP-PCR)，任意引物PCR(ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR);寡聚苷酸引物PCR(OligoPrimer-PCR,OP-PCR)等。这一类技术的共同特点是利用合成的随机引物(常为5~10个或更多个寡聚核苷酸)，通过PCR扩增不同生物个体的DNA分子，然后直接进行电泳分析来揭示其DNA的多态性。1.3重复序列为基础的DNA分子标记技术卫星DNA(Satellite重复序列为几百~几千个碱基对)，微卫星DNA(Microsatellite，重复序列单位为2~5个碱基对)，小卫星DNA(Minisatellite，重复单位为大于5个碱基对)等。1.4mRNA为基础的分子标记技术差异显示(DifferentialDisplay,DD)，逆转录PCR(RevertTranscriptionPCR,RT-PCR)差异显示逆转录PCR(DifferentialDisplayRevertTranscriptionPCR,DDRT-PCR)等[4]。2.DNA分子遗传标记鉴别的依据生药鉴定研究首先要找到具有物种特异性的遗传标记(geneticmarker)，这种遗传标记主要有形态、组织细胞、化学成分、蛋白质、染色体组型、血清学、同功酶等特征[5]。然而有些特征为生物体的遗传性和环境因素共同作用的结果，它们受到遗传因素影响的同时，还与生物体的发育阶段及环境条件对生物体的作用有着密切关系。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，用DNA分子特征作为遗传标记-即DNA分子遗传标记(DNAmoleculargeneticmarker)进行物种鉴别更加准确可靠。DNA分子是由A,T,C,G4种碱基构成双螺旋结构的长链状分子，遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同的物种其遗传性不同，遗传上的差异便表现在这4种碱基排列顺序的变化之中，这就是生物的遗传多样性(genetdiversity)。比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是DNA分子遗传标记鉴别(identificationbyDNAmoleculargenetmarker)。在真核生物中，其单倍体细胞的碱基对数(bp)在1O7～1O11之间，由于DNA分子的信息含量巨大，真核生物中各种基因所占基因组DNA的比例最多也不会超过20％。因此，在DNA分子上，有编码与物种存活密切相关的基因区域、编码与物种存活不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。基因组DNA的这些不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度的保守，后者所受选择压力小，表现出较大的变异。正是由于这种DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此，能够选择适当的DNA分子遗传标记，在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确地鉴别，这也是中药材品种DNA分子遗传标记鉴别的分子基础。DNA分子作为遗传信息的载体具有较高的遗传稳定性，较蛋白质、同功酶等还有较高的化学稳定性。在陈旧标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传标记的研究[6,7]，自聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)技术的建立并得到发展以来。人们甚至可以从数千年前遗留下来的的古代骨骼标本中提得微量的DNA，经PCR扩增后对其特定的DNA片段进行分子遗传标记的研究[8,9]。由于DNA分子所载信息量巨大，并且相对稳定，PCR技术具有高速、高效和特异性高等特点，因此用DNA分子遗传标记鉴别中药材品种和对中药复方制剂中组分的检测具有快速、准确、专属性强、重现性好等优点。3.DNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用DNA分子遗传标记方法用于生药鉴别中，首先要解决的问题是能否从陈旧的药材标本中提得药材本身的DNA，并能用于PCR扩增，这方面已有成功的报道[10]，其次是寻找一种检测药材DNA多态性的方法。3.1生药鉴定是生药学的重要组成部分对同属不同种药材鉴定及药材真伪鉴定，保证中医用药的准确性，维护人民身体健康具有重要意义。传统的中药鉴定主要依靠颜色、形状、气味、味道和质地等感性特征，这种鉴定方法的不足之处在于不准确而且对这些特征的把握因人而异。将组织学、形态学和化学法引人到生药鉴定上来，是生药鉴定的一个进步，但这些方法仍有很大的局限性。利用DNA分子遗传标记技术直接分析药材的DNA多态性，找出真品特有的DNA片段，对此进行测序，进而制备DNA探针，来检测相应的药材。是一种便捷、准确的生药鉴定方法。张荣等[11]用RAPD分析法对术蓝属(indigoferaeLinn)8种生药及铁线莲属(ClematisL)7种中药进行鉴定研究，效果很好，证明RAPD分析是一种有效的中药鉴定方法。3.2在药用植物亲缘关系上的应用肖培根院士建立了药用植物亲缘学，采用一些小分子化合物作为鉴定亲缘关系的依据，由于DNA从本质上反映了药用植物的亲缘关系，现在很多学者建议应把二者结合起来考虑。才能更有效地研究药用植物的亲缘关系。汪小全等[12]用5个引物对升麻属(cimicifugaL)的5个种和类叶升麻(ActaeaasiaticaHara)及乌头属(Actinium)的一种进行了RAPD分析，结合分析的结果，他们认为类叶升麻属与升麻属有较近的亲缘关系，而乌头属则与该属较远，这与经典分类学的研究结果相吻合。3.3在药用植物资源与生物多样性保护上的应用生物多样性的研究可以看作是对生物在空间上存在的现状和相互关系的研究，包括生态系统、区系种类和遗传结构等不同水平上的多样性研究。其中，遗传多样性的研究是生物多样性研究的中心环节。单纯用形态学和细胞学手段研究遗传多样性就失去了分辨能力；而分子生物学手段则使我们看到这些变化成为可能，从而针对性地制定有效的保护措施。目前在研究药用植物资源时，多采用经典的形态分类学方法，用该方法划分物种是建立在个体性状描述和宏观观测水平上，得到的结论往往不完善，易引起争论．同时这是不科学的，DNA分子遗传标记技术直接分析遗传物质DNA在不同生物个体间的差异，使植物分类和资源的研究更加科学化。3.4在药用植物道地性研究上的应用道地药材具有强烈的地域性，表现在它们往往分布在某些狭小的区域，或分布较广，但只有某些狭小生境区的质量好、疗效佳、产量最大[13]。药材道地性的原因就是植物的遗传物质DNA及初生和次生代谢过程中的酶系统发生了“道地性”变化。道地性药材与非道地性药材毕竟同种，甚至同一亚种。二者在形态和生药性状等特征上，差别往往不明显，给道地药材的鉴别带来了困难。采用DNA分子诊断技术并辅以等位酶技术，可以从分子水平上来揭示药材的“道地性”。对药材的“道地性”研究有重要意义。3.5在遗传育种上的应用药用植物的“优良品种”对药材生产存在着巨大的潜力，“高含量育种”是药用植物育种的主要目的和特色。遗传图谱是生物种类的分子档案，对育种工作者有极大的参考价值。目前应用RAPD技术已构建了一些重要农作物的遗传图谱[14]。但在药用植物方面还是空白，需加大这方面的研究，为药材的开发利用打下坚实的基础。4.DNA分子遗传标记技术存在的问题4.1没有构建真正意义上的数据库DNA分子遗传标记方法稳定性受模板、扩增条件的诸多因素的影响。另外没有构建真正意义上的数据库。鉴定微小种子类中药材时，模板DNA中可能含有两种以上植物的DNA，有关两种模板DNA同时存在对扩增结果的影响未见报道。DNA分子诊断技术对不同部位入药的药材难以区分，各部具有同样DNA标记式样。对于成药、复方、提取液的DNA标记未见报道[15]。4.2药材处理由于分子标记具有高度的灵敏性，药材中任何生物源的污染，如霉变、虫蛀，甚至人的触摸都会留下外源DNA分子,这种DNA在PCR扩增过程中可以一同被扩增，从而使得到的DNA指纹图谱失真。好在DNA分子标记研究所需要的实验材料非常少，通常在取样过程中一定要选择药材无霉变和虫蛀的部分，刮弃表面，从内部刮取极少量组织，或洗净药材表面，再用强紫外线照射药材表面，以彻底破坏表面的外源DNA。同时实验中应严守操作规程，避免二次污染。4.3提高稳定性中药材通常为动植物的干燥体，与分子生物学研究中常用的新鲜材料相比，均为陈旧标本，这对大片段的DNA扩增往往十分困难，而对小片段的DNA扩增影响不大。此外，某些分子生物学方法本身的稳定性问题尚待进一步提高，如RAPD虽然是首先被用于中药鉴定的DNA分子标记鉴别方法，但实验过程中实验条件的任何微小变化都会改变实验结果的一致性。4.4降低经济成本目前进行分子生物学实验仍需较高成本。但随着分子生物学的发展，产品规模化生产的形成，分子生物学实验用的一般消耗品价格将会有较大辐度地下降，如实验中用的随机引物已有商品化大量生产，现在每次反应所用引物的成本已大大下降，随着分子标记鉴别研究的深人，找到更为经济实用、准确可靠的方法是完全可能的5.展望当今分子生物学技术的发展日新月异，并广泛地运用到生命科学及各相关学科领域中。已有人提出分子生药学(MolecularPharmacog-nosy)这一新的概念[16]。DNA分子遗传标记技术在其应用过程中显示了广泛的前景，但此技术在药