2基因工程及其在食品工业中应用new

第二章基因工程及其在食品工业中应用第一节概述基因工程(Geneticengineering)，又称分子克隆(Molecularcloning)或重组DNA技术(RecombinantDNATechnology)，其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子转入受体细胞，使异源基因在其中复制表达，从而改造生物特性，大量生产出人类所需要的产物的高新技术。1/12/2020转基因西红柿1/12/2020抗虫害作物1/12/20201/12/2020番木瓜优良抗病品种1/12/2020金大米1/12/2020Copyright©Jiangyong地雷探测草拟南芥1/12/2020Copyright©Jiangyong不会引起过敏的大豆1/12/2020转基因芥菜可减轻土壤污染1/12/2020Copyright©Jiangyong彩色玉米1/12/2020巨型鲑鱼1/12/2020Copyright©Jiangyong荧光鱼1/12/2020Copyright©Jiangyong超级奶牛1/12/2020Copyright©Jiangyong培育出人耳的小鼠1/12/2020Copyright©Jiangyong转基因猪1/12/2020Copyright©Jiangyong基因工程1944年确认了遗传的物质基础是DNA。1953年JWatson和FCricK提出了DNA双螺旋结构模型，1958年MMesselson和FＷStahl证实了DNA半保留复制的机制，揭示了生物界遗传性状能世代遗传的分子奥秘。重要的里程碑：双螺旋结构的确立1962年WSzybalski和ESzybalski用人类DNA去转化人类细胞,发现Ca2+有刺激DNA转移入细胞的作用，是人工转移遗传物质给其它细胞的第1次尝试。1965年,Jacobf基因操纵子.1968年,NirenbergM,遗传密码.1967年Nirenberg提出遗传工程可用于人类的基因治疗。60年代分子生物学作为一门独立学科正式出现70年代初Graessmann和Dicumako莫定了用显微注射法转移基因。1972年Grahant等对磷酸钙介导的DNA转移过程进行了详细的研究，使这技术能被普遍接受和应用。1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子2种病毒DNA的重组1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验基因工程的开始1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)somatostatin生长素释放抑素70年代出现基因工程并有初步成果基因重组技术80年代的代表性研究领域基因工程产品的开发应用定点突变的研究与应用癌基因的发现DNA-蛋白质分子相互辨认PCR技术的出现人类基因组计划开始酝酿90年代基因诊断技术渐趋成熟基因治疗合法化人类基因计划的启动分子生物学各分支学科的建立与发展从20世纪50年代起，分子生物学领域的研究成果共获得40项诺贝尔医学-生理科学奖，说明分子生物学在生命科学研究中的重要性根据桑格法开发的DNA自动定序机使一周（24小时运转）解读100万甚至几百万个碱基成为可能。它为“人类基因组计划”立下了汗马功劳1/12/2020Copyright©Jiangyong理论基础DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译工程技术基因转移载体的发现工具酶的发现DNA合成和测序技术的发现DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物的问世PCR技术的发明1/12/2020Copyright©Jiangyong第二节工具酶已学：基因工程的“专用工具”基因的剪刀——限制性核酸内切酶基因的针线——DNA连接酶基因的运输工具——运载体一、分子手术刀----限制性核酸内切酶(限制酶)磷酸二酯键EcoRI、SmaI限制酶提醒①切割的化学键为磷酸二酯键。②在切割目的基因和运载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。③将一个基因从DNA分子上切割下来，需要2个限制酶，同时产生4个黏性末端1/12/2020Copyright©Jiangyong限制性核酸内切酶(限制酶)来源：主要从原核生物中分离化学本质：蛋白质作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。特性：特异性。即限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，切割特定位点切割后的DNA末端：黏性末端；平末端限制性核酸内切酶的命名(1)根据酶相应来源的微生物的学名，取其属名的第一个大写字母和种名的头两个字母(小写)组成酶的基本名称(斜体)；(2)若微生物有不同的株系，取其株系的第一个字母加于酶名称之中；(3)用大写的罗马数字来区分存在于同种微生物中具有不同酶切活性的内切酶。例如：从流感嗜血杆菌d株中先后分离到3种限制性内切酶，分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。酶的来源：Haemophilusinfluenzaed（属名）（种名）（菌株）限制性核酸内切酶种类•已经发现的限制性核酸内切酶有三类•Ⅰ类：由3种不同亚级构成，兼具修饰酶活性和依赖于ATP的限制形内切酶活性，结合于特定的DNA序列位点，随机切断识别位点以外的DNA序列。•Ⅱ类：与Ⅰ类酶相似，是多亚级蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。•Ⅲ类：只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。二、分子缝合针----DNA连接酶常用种类T4DNA连接酶：既能“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，也能“缝合”双链DNA的平末端（效率低）E·coliDNA连接酶：只能将双链片段互补的黏性末端连接三、DNA聚合酶Ⅰ催化聚合脱氧核苷酸，使之逐个接到引物上去，最后形成新的DNA。主要用来作DNA探针的体外标记，即缺口翻译；也用于酶法测定DNA序列。四、碱性磷酸酯酶催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’-磷酸残基，即脱磷酸作用。可以防止载体DNA自我环化，从而提高重组效率。五、T4多聚核苷酸激酶催化ATP上的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’-OH上，主要作为DNA的5’-末端标记，标记待测的DNA片段。六、S1核酸酶从具有单链末端的双链DNA分子中除去单链生成钝端，以及打开双链cDNA合成中生产的发夹结构。七、反向转录酶用于催化合成与某种已知RNA互补的DNA链，以获得目的基因，在基因克隆中也是一种不可缺少的工具。第三节目的基因的制备目的基因的制备方法一、生物学法二、化学合成法三、基因文库法四、PCR扩增法常用载体•质粒•λ噬菌体的衍生物•动植物病毒第四节基因载体作为基因载体应具备的条件：(1)本身是一个复制子，能自我复制；(2)相对分子质量要小，小分子DNA易处理，限制性内切酶切点少，适于接受目的基因(外源基因)；(3)能给寄主细胞(受体细胞)提供可选择标记、可供辨认的表形特征，以便人们进行筛选。(4)只有单一限制性内切酶切点，经某一限制性内切酶切割后，既可以把质粒DNA闭环打开以接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。1/12/2020Copyright©Jiangyong1/12/2020(1)载体是基因运输工具，在基因操作过程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)种类：质粒(既存在于原核生物细菌中，也存在于真核生物酵母菌中)、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。(3)本质：DNA(其中质粒为环状DNA分子)(4)作为载体必须具备三个条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。②有1个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，以便进行筛选。1/12/2020Copyright©Jiangyong1/12/2020Copyright©Jiangyong注意问题(1)一般来说，天然载体往往不能同时具备载体必须具备的条件，所以在基因工程中需要根据不同的和需要，对载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。1/12/2020Copyright©Jiangyong(2)作为载体必须具有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制性内切酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。1/12/2020Copyright©Jiangyong(3)大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。它存在于细菌的细胞质中，上面一般含几个到几百个基因，控制着细菌的抗药性、固氮、抗生素合成等性状。由于土壤农杆菌很容易感染植物细胞，使细胞生有瘤状物。所以科学家培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做载体。(4)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。第五节基因重组将目的基因和载体DNA在体外连接构建形成重组子。黏性末端连接法：直接粘接法加尾粘接法平头连接法第五节转化、增殖和表达一、转化1.受体细胞：指在转化、转导中接受外源基因的细胞。受体细胞应具备的性能：具有接受外源DNA能力；应为限制性内切酶缺陷型菌株或者为DNA重组型菌株；在标记上和载体相对应；有利于表达，如选择核糖体对mRNA识别专一性较低的突变株；不适于在人体内或在非培养条件下生存，有利于安全。常用受体细胞：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌放线菌：链霉菌酵母菌2.感受态：感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。转化效率影响因素：对数生长期的细胞转化能力最强；氯化钙处理和电处理能提高转化效率；原生质体转化。3.扩增检筛用含抗生素的培养基进行初筛，然后通过原位杂交、电泳等方法筛出带有目的基因的转化子。二、基因表达基因表达：通过DNA重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，并使特定基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质(或酶)，甚至进而获得它们的代谢产物，这一过程称为基因表达。操作在绿色纸上写上…GGCTCCCGGGAATTCATTTTG……CCGAGGGCCCTTAAGTAAAAC…在红色纸上写上…TCCCGGGAATTCCCGGGAATTCTA……AGGGCCCTTAAGGGCCCTTAAGAT…如果用EcoRⅠ限制酶，情况?用什么酶连接？如果用SmaⅠ限制酶，情况?用什么酶连接？操作中涉及到的用具和材料分别绿色纸红色纸剪刀透明胶条连接好的绿红纸条基因工程的基因操作步骤第七节基因工程在食品工业中应用一、利用基因工程改造食品微生物二、转基因动物食品三、转基因微生物食品一、利用基因工程改造食品微生物应用：提高食品产品品质。简化工艺，缩短生产周期。食品的抗菌和防腐保鲜。食品级酶制剂的生产菌的改良。生产保健食品有效成分。食品微生物快速检测。实例：改良面包酵母，使其麦芽糖透性酶及麦芽糖酶含量提高；将大麦中的α-淀粉酶基因转入啤酒酵母中并实现高速表达，使啤酒酵母具有α-淀粉酶活性；将霉菌的淀粉酶基因转入E.coli，进一步转入酵母单细胞中，使之直接利用淀粉生产酒精。二、转基因动物食品实例：给母牛注射牛生长激素（bovinesomatotropin，BST），提高母牛产奶量；给猪注射猪生长激素，提高其瘦肉含量；动物生长激素（porcinesomatotropin，PST），可加速动物生长、改善饲养动物的效率、改变营养品质。三、转基因植物食品基因工程改造马铃薯提高其固形物含量；提高大豆、油菜植物油中不饱和脂肪酸的含量；改善谷物蛋白质中的氨基酸比例；延缓果蔬成熟、控制果实软化、提高抗病和抗冻力。四、食品与基因工程产业化利用基因工程生产凝乳酶