环境微生物实验-南开大学环境科学与工程学院TheCol

环境微生物实验环境科学与工程学院实验一培养基的制备培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。一、实验目的学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤二、实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液。可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、10％NaOH溶液、10％盐酸。(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。三、方法与步骤1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制(1)培养基配方：牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.0。(2)操作步骤：1）称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2）加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中．需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3）调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol•L-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol•L-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4）过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。5）分装披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图4－1)。分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面（图4－2）。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜．灭菌后垂直待凝。6）加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法如图4—3。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3／5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7）包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37℃温室培养24h，无菌生长者方可使用。图例图4－1培养基分装图4－2斜面制作图4－3棉塞制作方法2、高氏一号培养基的制备(1)培养基配方：可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.2~7.4。(2)操作步骤：1）称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g•L-1的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后．补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2）pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。3．常用的真菌培养基配方（1）马铃薯培养基：用以分离培养霉菌、酵母菌马铃薯(去皮)200g葡萄糖(或蔗糖)20g琼脂20g水1000mLpH自然121℃灭菌30min上述培养基中加入1％的酵母粉或蛋白胨，则能促进孢子的大量增加。（2）蔗糖硝酸钠培养基（察氏培养基）：适合于鉴定多数霉菌蔗糖30gK2HPO41gKCl1gNaNO42gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g水1000mLpH6.7如用以分离霉菌时．可加乳酸调节成pH5.0～5.5，制成酸性培养基。（3）马丁(Martin)孟加拉红一链霉素培养基：葡萄糖10g蛋白胨7gK2HPO41.0gMgSO4·7H2O0.5g孟加拉水溶液(1／3000)100mL水800mL121℃灭菌30分钟使用时加链霉素：1取国产1g装链霉素一瓶．用无菌注射器注入无菌蒸馏水5mL。溶解后，吸取出0.5mL链霉素溶液，移注入330mL无菌蒸馏水即得0.03％链霉素。2上述基础培养基在沸水锅中融化后冷却至55~60℃，每10mL基础培养基加1mL0.03％链霉素溶液(含链霉素30μL•mL-1)（4）麦芽汁培养基：麦芽汁20g蛋白胨1g葡萄糖20g水1000mL琼脂20gpH5（5）豆芽汁培养基，适用于酵母和霉菌。黄豆芽（或绿豆芽）100g白糖（或蔗糖）10～30g琼脂20g水1000mL先将洗净的豆芽放在水中煮沸30min，用2层纱布滤去豆芽，将豆芽汁补足水分，加糖（培养酵母时糖量要高）pH自然。四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。五、实验报告记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。六、问题和思考1．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？3．牛肉膏蛋白胨培养基属何种培养基？它除了培养细菌外，能培养真菌和放线菌吗？高氏培养基属何种培养基?除培养放线菌外高氏培养基还能培养细菌和真菌吗?为什么?采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。实验二消毒和灭菌一、实验目的和内容目的：了解消毒和灭菌的原理并掌握各种灭菌方法的操作步骤。内容：1．高压蒸汽灭菌法。2．干热灭菌法。3．过滤除菌法。二、实验材料和用具待灭菌的培养基和链霉素溶液。高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱、过滤除菌器、培养皿、试管三、操作步骤(—)高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。1．加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。2．装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。3．加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；4．排气加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。5．升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。6．保压当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。7．降压达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。8．无菌检查将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。(二)干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；1．装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。2．升温关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160～170℃)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。3．恒温当温度升到所需温度后，维持此温度2h。4．降温切断电源，自然降温。5.取出灭菌物品待电烘箱内温度降到70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。(三)过滤除菌法有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因而要采用过滤除菌法。1．过滤器的种类(1)滤膜过滤器：由醋酸纤维素、硝酸纤维素等制成，有孔径大小不同的多种规格(如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等)，过滤细菌常用0.45μm孔径。其优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，滤速快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。(2)蔡氏滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大。每张纤维板只能使用1次。(3)玻璃滤器：是一种由玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器规格很多，5号(孔径2—5μm)和6号(孔径小于2μm)适用于过滤细菌。其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。清洗方法是：用水充分冲洗，然后浸于含1％KNO3的浓硫酸中24h，再用蒸馏水抽洗数次。在抽洗液中加人数滴BaCl2，至不出现BaSO4沉淀时，即表示已洗净。2．过滤装置（1）按图4-4进行安装，为阻止空气中细菌进人滤瓶而在接管处塞入棉花、外用纸包好进行121℃湿热灭菌20min。(2)为加快过滤速度，一般用负压抽气过滤，可接真空泵进行抽滤。四、注意事项1．使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。2．干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触．以免包装纸烤焦起火。3．过滤除菌时应注意检查过滤装置各连接处是否漏气，以防污染。五、实验报告1．记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温度、压力等)。2．试述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。六、问题和思考1．比较各种灭菌方法的原理及适用范围。2．高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。实验三微生物的接种技术一、实验目的：了解各种微生物接种方法。二、实验材料和用具：已灭菌培养基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔三、实验步骤：1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。。(2)点燃酒精灯。(3)接种用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下：1)手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中．使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环右手拿接种环，在火