3-2016基因工程原理ds-测序技术

中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室基因工程原理何光源2016-3-10中英联合实验室第三章测序技术第一节DNA测序策略第二节传统的DNA序列分析法第三节第二代测序技术简介第四节第三代测序技术2020/1/12中英联合实验室造福人类的HGP人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。2020/1/12中英联合实验室第一节DNA测序策略DNA的测序策略因待测DNA分子性质、测序方法和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以及现有设施来制定测序总策略。一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略2020/1/12中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略确证性测序（confirmatorysequencing）：对已知的核酸序列进行鉴定和证实；例如：临床分子诊断中，对有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变；不仅有助于临床诊断，还有助于探索有关疾病的发病机理及基因突变引起的表型变化。2020/1/12中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略多数情况下，确证性测序的DNA片段较小，一套反应即可获得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只需对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序；待测DNA片段位于通用引物的测序范围之内时，可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为“通用引物”；否则，最好的方法是合成一段长度为18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。2020/1/12中英联合实验室二、未知序列的测序策略未知序列DNA的从头测序（denovosequencing）是指确定一个未知DNA序列的准确长度及核苷酸排列顺序；测序策略因待测DNA的长度而异，只有1kb左右的待测DNA可选用定向测序法，过长的DNA可选用随机测序法。2020/1/12中英联合实验室（一）随机测序法随机测序法（randomapproach）：包括鸟枪法与人工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完整的序列信息。2020/1/12中英联合实验室（一）随机测序法鸟枪法shotgunstrategy利用超声处理、核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）切割或限制性酶切割，将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行DNA序列测定，然后将序列重叠排列，确定待测DNA的完整序列；该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准确；但由于测序的亚克隆是随机挑选出来，某些序列可能多次重复测定，而一些序列一直不出现，通常要测定比实际靶DNA所含核苷酸多4～7倍的序列；如果靶DNA含较多的重复序列，计算机将难以进行分析。2020/1/12中英联合实验室（二）定向测序法定向测序法（directedsequencing）：指从待测DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待测DNA的序列全部测完；该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。2020/1/12中英联合实验室（二）定向测序法1．嵌套缺失法嵌套缺失法（nesteddeletion）：利用工具酶酶解待测DNA，只要控制消化时间，即可产生一组从同一端缺失的长度不一的互套缺失突变体，测定其序列，通过相互重叠部分将相邻片段的序列彼此拼接，如此重叠互套，获得待测DNA的全序列；产生互套缺失突变体的主要工具酶：核酸外切酶III、核酸酶Bal31、DNA酶I和T4DNA聚合酶。2020/1/12中英联合实验室（二）定向测序法用外切酶Ⅲ构建互套缺失突变体测序方法示意图2020/1/12中英联合实验室（二）定向测序法2．引物步入法引物步入法（primerwalking）：从待测DNA片段的3’端开始，利用载体上的序列设计第一次反应的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进测序，直至完成，得到靶DNA的全部序列。2020/1/12中英联合实验室（二）定向测序法引物步入法测序原理示意图2020/1/12中英联合实验室KeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNAhybridizationtechnique1977-Sanger’schain-terminationandMaxam、Gilbert’schemicalDNAsequencingmethods1980-Automatedinsituoligonucleotidesynthesisinstrument1985-Mullis’sdiscoveryofPCRatCetus1992-Affymetrix(Fodor’sgroup)firstgene-chip1995-ABI’sfirstautomatedDNAsequencer2006-2ndgenerationDNAsequenceronmarket2007andbeyond–Singlemoleculesequencingtechniques2020/1/12中英联合实验室测序技术的发展双脱氧末端终止法(Sanger测序法)1970s同位素标记，手工1980s荧光标记，自动1990s毛细管电泳合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）连接测序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）单分子测序技术（第三代测序）HelicosPacificBiosciencesOxfordNanopore2020/1/12中英联合实验室第二节传统的DNA序列分析法Sanger双脱氧链终止法Maxam-GilbertDNA化学修饰法DNA杂交测序毛细管电泳DNA序列分析的自动化2020/1/12中英联合实验室1970年发明了第一种DNA测序方法2020/1/12中英联合实验室Sanger双脱氧链终止法Sanger于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。2020/1/12中英联合实验室一、基本原理单链DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长2020/1/12中英联合实验室双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH2020/1/12中英联合实验室在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室双脱氧链末端终止法测序原理示意图2020/1/12中英联合实验室二、测序反应体系的组成（一）待测模板1．单链模板DNASanger法经典测序反应--将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。2．双链模板DNA将待测的DNA片段克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片段的双链质粒，经碱变性处理，与寡核苷酸引物序列退火，按Sanger法进行测序；2020/1/12中英联合实验室Sanger双脱氧-M13体系M13--噬菌体载体，可得到单链DNA序列Sanger双脱氧-pUC体系pUC-质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室二、测序反应体系的组成（二）引物“通用”引物：在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物；通用引物长度：一般为15～30个核苷酸。2020/1/12中英联合实验室二、测序反应体系的组成（三）DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：Sanger法最早使用的酶，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，催化链延伸反应的能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带；2．测序酶（sequenase）：经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常稳定，很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，测定较长DNA的首选酶；3．TaqDNA聚合酶：PCR反应关键酶，在95℃的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。2020/1/12中英联合实验室二、测序反应体系的组成（四）放射性核素标记的dNTPα-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。2020/1/12中英联合实验室二、测序反应体系的组成（五）测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。2020/1/12中英联合实验室三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基序列；2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。2020/1/12中英联合实验室Maxam-GilbertDNA化学修饰法1977年哈佛大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明原理：化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割产生一组具有不同长度的DNA链混合物经凝胶电泳分离和放射自显影，读出待测DNA片段的核苷酸序列2020/1/12中英联合实验室由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的化学切割反应的试剂：肼hydrazine联氨NH2-NH2硫酸二甲酯dimethylsulphate六氢吡啶2020/1/12中英联合实验室碱性条件下，肼与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）作用通过六氢吡啶作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂盐存在的条件下，肼同T的反应被抑制，只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应由此区别C和C+T两种反应2020/1/12中英联合实验室硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）一种碱性的化学试剂作用于DNA碱基环中的氮原子，使之甲基化在中性的pH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱碱性条件下磷酸分子从DNA链上脱落，造成链的断裂鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3六氢吡啶作用，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂2020/1/12中英联合实验室2020/1/12中英联合实验室CS载体系统：末端标记载体核酸内切酶Th111