环境微生物实验指导内容-生命科学学院本科基础实验教学中心

第一部分基础实验实验一显微镜的基本构造、使用和保养一、目的要求1.熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、显微镜的基本构造显微镜是由机械装置和光学系统两大部分组成。1．机械装置镜座(base)和镜臂(arm)镜座位于显微镜底部,呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒(bodytube)是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器(nosepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装3—4个物镜,可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台(stage)又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarseadjustment）即粗调节器和微动螺旋（fineadjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2．光学系统物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA0.30；10×；160/0.17；16㎜。其中“NA0.30”表示数值孔径（numericalaperture,简写为NA），“10×”表示放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（㎜），“16㎜”表示焦距。目镜（coularlens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（irisdiaphragm）组成，聚光镜由透镜组成。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。光源（lightsource）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按扭开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、器材显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯、染色玻片标本四、显微镜的使用(1)安放显微镜打开镜箱，右手紧握镜臂，左手平托镜座，轻放桌上，距离桌子边缘几厘米处，使目镜对着观察者。（2）检查检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。（3）对光配置内置式电光源的显微镜可直接打开电源开关，并调节光量，使视野内的亮度达到明暗适宜，同时打开光圈。旧式显微镜应首先将虹彩光圈的孔径调至最大，将聚光器升至最高点，再将低倍镜对准镜台孔，镜头离载物台约1㎝。这时，把反光镜转向光源，直到视野中的光线既明亮又均匀时为止。在镜检全过程中，根据所需光线的强弱，还可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器加以调节。（4）调焦光线对好后，将玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上，被检物体对准镜台孔正中，用标本移动器上的压片夹卡紧，然后调焦。转动粗调焦螺旋调节镜台与物镜间的距离，从侧面注视，以二者间距离5㎜为度。然后自目镜观察，慢慢转动粗调焦螺旋，同时移动标本移动器，直到基本看清标本物像。（5）低倍镜观察用粗调焦螺旋调焦后，再轻轻转动细调焦螺旋，以便得到清晰的物像。如果观察的目标不在视野中央，可调节标本移动器，使之恰好位于视野中央。若光线不适，可拨动虹彩光圈的操纵杆，调节光线至适宜。（6）高倍镜观察在低倍镜下将观察的标本部分移至视野中央，再转动镜头转换器，将高倍物镜转至工作位置。适当调节亮度后，只需微微转动细调焦螺旋，就可看到更清晰的物像。切记此时不能使用粗调焦螺旋，由于显微镜下观察的被检物有一定厚度，故在观察过程中必须随时转动细调焦螺旋，以了解被检物不同光学平面的情况。在高倍镜下，将玻片中的被检物按从上到下、从左到右的顺序移动、观察一遍，再由低倍镜转高倍镜反复观察几次，以熟练高倍镜使用。用高倍镜观察后，若有必要，可再换用油镜观察。（7）油镜观察转动粗调焦螺旋，使物镜与镜台保持一定距离。滴1滴香柏油于玻片标本待观察的区域上，将油镜头转至工作位置，眼睛从侧面注视，转动粗调焦螺旋，直至油镜头浸没于香柏油内，几乎与载玻片相接触，但不能相碰。然后从目镜中观察，用粗调焦螺旋极其缓慢地向上调节至出现物像为止，注意勿将粗调焦螺旋转动方向搞反了，以免油镜头与载玻片相碰而损坏了镜头及玻片。再用细调焦螺旋调至物像清晰，此时还应适当增加光的亮度。如果镜头已提出香柏油而尚未见到物像时，应按上述过程重复操作。使用完毕，将镜头从香柏油中脱离，取下玻片，用擦镜纸擦去镜头和玻片上的香柏油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头上的油迹，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。二甲苯用量不宜过多，擦试时间应短。切忌用手或其他纸擦试镜头，以免损坏透镜。（8）复原显微镜使用完毕，关闭电源，将物镜镜头转开，取下玻片。擦净载物台和物镜，将各部分还原，注意物镜头不可正对镜台孔，装镜入箱。五、显微镜的保养显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。一架显微镜的机械装置虽好，但光学系统不好，这架显微镜是不会起好作用的。因此，对显微镜要妥善保管。1．避免直接在阳光下曝晒，因为透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻油仁粘合起来的。金属与透镜膨胀系数不同，受高热因膨胀不均，透镜可能脱落或破裂，树脂受高热溶化，透镜也会脱落。2．避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放，碘片、酒精、醋酸、盐酸和硫酸等对显微镜金属质机械装置和光学系统都是有害的。3．透镜要用擦镜纸擦拭，若仅用擦镜纸擦不净，可用擦镜纸蘸二甲苯拭擦，但用量不宜过多，拭擦时间也不宜过长，以免粘合透镜的树脂被溶化，而使透镜胶落。4．不能随意拆卸显微镜，尤其是物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸，因拆卸后空气中的灰尘落入里面引起生霉。机械装置经常加润滑油，以减少磨擦而受损。5．避免用手指沾抹镜面，否则会影响观察，沾有有机物的镜片，时间长了会生霉，因此，每使用一次，所有的目镜和物镜都得用擦镜纸擦净。6．显微镜放在干燥处，镜箱内要放硅胶吸收潮气。目镜、物镜放在盒内并存于干燥器中，以免受潮生霉。六、几种特殊光学显微镜介绍1.相差显微镜相差显微镜与普通光学显微镜在构造上的不同之外是在聚光镜下面装有一个环状光阑（加绿色滤光片），并且其物镜是装有相板的相差物镜。此外，它还具有一个调整光线的“合轴望远镜”（又称“辅助远焦镜”）。环状光阑的作用是形成一个空心的光线锥，造成透过标本的光线分离成直射光和衍射光2组光线。这2组光线分别从相板上的环区和环外区通过，导致它们之间微弱的相位差人为地扩大增强，进而在上面透镜的收敛作用下，这2组光线复在一条光路上发生干涉效应，使得相位差转变成振幅差（即明暗差），反差增强。因而通常在显微镜上难以观察到的细胞细微结构，就可以利用相差显微镜看清楚，同时增强被观察物体的立体感，即景深加大，以利于观察物体的全貌。在细胞显微操作时尤其需要相差显微镜。合轴望远镜是用在相差显微镜上调节光轴的辅助设备，它不能用来观察被检标本。相差显微镜主要用于观察未染色的活细胞，亦可用于观察固定过的材料。被检材料厚度不超过20μm，载玻片要求厚薄均匀，厚度在1㎜左右，盖玻片的厚度要求在0.17㎜左右。2.暗视野显微镜暗视野显微镜是按照丁达尔（Tyndall）光学效应原理，在显微镜基本结构上换装暗视野聚光镜，使照射被检物体表面的光线不能直接进入物镜与目镜，而利用被检物体表面的散射光线来观察，其分辨力可达0.2～0.004μm，这是普通光学显微镜远不可及的。它的成像特点是：黑暗的视野中可见明亮的被检物体的明细外貌及其运动，但是看不见被检物体内部的细微结构。暗视野显微镜要求载玻片厚度在0.7～1.7㎜之间。3.偏振光显微镜偏振光显微镜是在普通光学显微镜的结构基础上，加上2块能使光线偏振的尼科尔棱镜。装在聚光镜下面的那一块称为起偏镜，装在目镜与物镜之间的一块称为检偏镜。这2块棱镜中的一块固定，另一块可以旋转（或者2块均可旋转），并注有刻度。另外，偏振光显微镜的镜台亦能旋转。偏振光显微镜是利用偏振光来鉴别晶体和生物体内某些有序结构的光学性质，同时也可用来鉴别某些组织中的化学成分。4.荧光显微镜荧光显微镜是利用激发的照射，使标本内的荧光物质被激发出各种不同着色的荧光，从而分辨标本内某些物质的性质和位置。也可以用显微镜外加轻便荧光光源代替荧光显微镜，其观察原理相同，只是观察效果略差。荧光显微镜主要用于观察材料中荧光染料着色的色素颗粒等特殊成分。5.倒置显微镜倒置显微镜是将光路反转，光线由上往下照射被检物体，再经过反光镜进入目镜。此种显微镜充分利用聚光镜与载物台之间的距离，主要用来观察培养器皿中的细胞和进行显微操作，当然亦可被用作显微镜。七、实验报告1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的细菌个体形态。2.在使用油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？3.使用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？4.镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不是直接用高倍物镜或油镜观察？实验二细菌个体形态的观察一、目的要求1．学习观察细菌的个体形态2．学会生物图的绘制二、基本原理细菌的个体形态是指细菌细胞的大小，形状等特征，利用观察个体形态对细菌进行初步识别和鉴定。三、器材显微镜、细菌三型涂片、双层瓶（二甲苯、香柏油）、擦镜纸四、操作步骤1．观察前的准备（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3-4㎝，镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。（2）调节光源、光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。2．低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将三型涂片玻片标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，物镜降至距标本约0.5㎝处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。3．高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没找到，要用低倍镜重调，如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物，若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。4.油镜观察（1）用粗调节器将镜筒提起约2㎝，将油镜转至正下方。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油，切勿加多。（3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心