生化科技学系微生物学组专题讨论

生化科技學系微生物學組專題討論題目:ABacteriumTargetsMaternallyInheritedCentrosomestoKillMalesinNasonia作者：PatrickM.Ferree,AmandaAvery,JorgeAzpurua,TimothyWilkes,andJohnH.Werren文章來源：CurrentBiology18,1409–1414,September23,2008演講人：Chain-JiaLin林千佳B94B02031指導老師：Chii-ShenYang,Ph.D.楊啟伸博士演講日期：May19th,2009演講地點：The6thclassroom摘要雄殺性(male-killing)的寄生菌廣泛存在於自然界中，對節肢動物影響甚鉅。雄殺性現象造成的不僅是宿主族群雌雄比例的嚴重扭曲，同時有可能影響宿主的行為與繁殖模式；許多雄殺性細菌會阻礙族群間基因的平行交流，可能推波助瀾地影響新物種的分化與形成。在物種演化上所扮演的角色，使雄殺性寄生菌受到廣泛的注目，然而我們對其機制的了解仍十分有限。在此篇文章中，作者利用膜翅目小蜂總科的胡蜂Nasoniavitripennis，以及其對應的雄殺性寄生菌Arsenophonusnasoniae展開了一系列研究，並提出一個不同以往的雄殺性機制。研究揭示了雄殺性寄生菌A.nasoniae乃是藉由阻礙母系遺傳的中心體(maternallyinheritedcentrosomes)生成，造成雄性胚胎在發育的極早期便死亡。Keywords：sex-ratio;son-killer;male-killing;parasitoidwasp;Wolbachia;Drosophila;insect;parthenogenesis;organization;vitripennis;chromosome前言Š本研究之重要性雄殺性寄生菌在昆蟲間相當普及，七成以上的種可成為其宿主，每一物種內的被感染率普遍在5%-50%，有些甚至達90%以上(如非洲細蝶Acraeaencedana)。雄殺性寄生菌可同時感染雌性與雄性，但只會造成雄性死亡，以非洲細蝶為例，有些地區雌雄比例可達700：1，嚴重的性別比例失衡改變了宿主的行為與繁殖模式，可對宿主產生深遠的影響。除了行為上的影響，雄殺性細菌也由其他路徑改變宿主，如使感染者與未感染者間的配子不相容以利其在族群中傳播[1]，但如此一來即造成了族群間的基因交流受阻，可能間接推動了新種的形成。生物學家先前總是想像新種的出現肇因於地理隔離，如山脈隆起或是海島環境限制了基因的流動，如今細菌竟可能成為另外一個演化推手。雄殺性寄生菌在昆蟲族群間驚人的感染比率、以及在演化上可能扮演的角色，使得了解雄殺的作用機制變得十分迫切。Š前人作過的研究A.nasoniae屬於γ-變形菌門(γ-proteobacteria)，是膜翅目小蜂總科的胡蜂Nasoniavitripennis的雄殺性寄生菌，只在N.vitripennis的體細胞與生殖細胞的組織液中被發現，受其感染的雌性產下的雄性卵通常無法孵化為幼蟲，於胚胎期間便死亡[2]。N.vitripennis是數種蠅類的寄生蜂，雌蜂將卵產在宿主蠅的蛹上，孵化而出的幼蟲以蠅蛹為食。N.vitripennis的性別由受精與否決定，受精卵會發育成雌性(雙倍體dipoid)，反之則為雄性(單倍體haploid)，此生殖方式稱為孤雌生殖(parthenogenesis)。孤雌生殖的一個重要特性是：雌性受精卵初次分裂所需的中心體由精子提供；雄性未受精卵則由母系遺傳(來自卵子合成)的中心體完成[3]，也就是僅有未受精卵需要母系遺傳的中心體。Š本研究欲完成之項目根據雄性在胚胎期間死亡與孤雌生殖的特性，作者假設A.nasoniae的雄殺機制是以母系遺傳的中心體為標靶，抑制其活性或生成來阻斷雄性胚胎的發育。作者建立了兩條宿主生產線，並將之分為A.nasoniae感染與未經感染組，藉由比較實驗與控制組之間胚胎發育的差異，來建立A.nasoniae的雄殺機制。Š作者為何要作本研究目前對於雄殺機制的了解，多半來自於沃巴赫屬菌(Wolbachia)的研究，然而本研究所使用的A.nasoniae與沃巴赫菌有很大的差異，首先，兩者的宿主性別決定方式不同：N.vitripennis乃是藉由單雙倍體來區別性別；而沃巴赫菌的宿主如鼠婦(Armadillidiumvulgare)，則是使用WZ系統(雌性是WZ，雄性則是ZZ染色體)；此外，沃巴赫菌直接感染並影響配子細胞，而A.nasoniae並不感染配子或是胚胎，顯示A.nasoniae與沃巴赫菌所使用的雄殺機制必定完全不同，因此研究A.nasoniae能幫助我們對雄殺機制有更全面、多元的了解。材料與方法Š宿主生產線兩條實驗用標準的N.vitripennis生產線作為實驗中的野生型控制組：LabII與AsymC，其中LabII為沃巴赫菌感染，AsymC則否。值得一提的是沃巴赫菌在此實驗中並不造成N.vitripennis的雄殺作用，作者利用沃巴赫菌會累積在星狀微管(astralmicrotubules)周圍的特性，來觀察中心體的存在與狀態。讓LabII與AsymC生產線中的雌性胡蜂與被A.nasoniae所感染之雌蜂共同產卵在同一宿主麗蠅蛹(blowflypupae)上，將會使得實驗生產線被感染，所產生的子代F1自交後得到LabII(INF)與AsymC(INF)兩組感染A.nasoniae的實驗組生產線。Š胚胎收集與樣本固定為得到能產生雄性的未受精卵，未經交配的雌蜂以1：1的蜂蜜混和水餵養2至3日後，讓其在麗蠅蛹上產卵。視所需要的生長階段而定，產卵後經過2或5小時的胚胎先以100%甲醇固定，染色前再用1倍的PTX浸潤之。觀察極早期的母系遺傳中心體時，先將胚胎切片再以甲醇完全固定，同時讓抗α微管蛋白(anti-α-Tubulin)的抗體得以深入胚胎。Š免疫染色法(Immuno-staining)觀察微管與副核(accessorynuclei)9一次抗體：小鼠抗α微管蛋白抗體(mouseanti-α-Tubulin,Sigma)1/500倍稀釋，兔子抗層蛋白抗體(rabbitanti-Lamin)1/1000倍稀釋9二次抗體：與螢光染劑Cy3或Cy5結合的抗小鼠抗體/抗兔子抗體，皆為1/300倍稀釋(Invitrogen)一次抗體加入樣本後放置於4°C隔夜，接著以1×PBTA清洗三次後加入二次抗體，於室溫下放置1.5小時後以LeicaDMIRB共軛焦顯微鏡觀察。Š利用DNA染色法觀察染色體與沃巴赫菌(Wolbachia)[4]樣本稍微以DNA螢光染劑Oligreen(1/1000,MolecularProbes)或DAPI(inVectashieldmountingmedium,VectorLabs)浸泡後再以共軛焦顯微鏡觀察。結果與討論ŠA.nasoniae感染確實會造成宿主雄性胚胎死亡率的上升交配過的雌性胡蜂N.vitripennis理論上能產生雌性以及雄性的後代，其中受精卵為雌性，未受精卵則為雄性。比較野生型生產線LabII、AsymC與感染雄殺性寄生菌的生產線LabII(INF)、AsymC(INF)四者中，經交配的雌蜂所產下的子代後，發現A.nasoniae的感染造成了LabII(INF)及AsymC(INF)的雄性子代數量明顯下降(表一)。未經交配過的N.vitripennis所產下的子代皆是未受精的雄性胚胎，比較LabII與LabII(INF)未經交配雌蜂產下的子代的結果(表二)與前一實驗相符，LabII的子代存活率有87.9%，而LabII(INF)下降至24.5%。Š經A.nasoniae感染的宿主產下之雄性胚胎無法完成正常的細胞分裂為了找出雄性胚胎死亡的原因，在產卵後0-5小時內，以DNA染色觀察LabII與LabII(INF)兩生產線中未經交配雌蜂所產的胚胎。野生型LabII中約有一半的胚胎分裂速度較快(圖一、B)，細胞數量多，細胞核遍布整個胚胎表面；另一半分裂速度較慢者(圖一、A)細胞核數量雖少，但彼此間隔均勻且分裂同步(圖一、A’,B’)。相反地LabII(INF)生產線下的胚胎顯示其無法完成正常的細胞分裂(圖一、C,D)，細胞數量少，染色體多呈現高度聚縮(hypercondensed)狀，細胞核間隔不均勻且分裂亦不同步(圖一、C’,D’)。ŠA.nasoniae感染會造成宿主雄性胚胎中心體活性被抑制由微管的免疫染色結果可發現，與野生型LabII比較之下，LabII(INF)的胚胎微管數量低下、染色體高度聚縮、紡錘絲結構不完整、缺乏星狀體(aster)，這些現象都提供了一個假設：這些胚胎缺乏中心體，或是中心體的活性被抑制。為了找出A.nasoniae的雄殺機制與母系遺傳中心體的關連，作者接著使用產卵後0-2小時內收集並固定的雄性胚胎，這些胚胎尚處在發育極早期的階段，也是母系遺傳的中心體還存在的時期[5]。作者在此使用DNA染色來觀察沃巴赫菌於胚胎中的分布，沃巴赫菌已經被證實會聚集在微管周圍，因此在中心體處會聚焦成一個亮點[4](圖三、B-D)。與野生型對照組相較之下，LabII(INF)的沃巴赫菌呈現不正常地均勻散布(圖三、F-H)，並沒有聚焦的現象，顯示沒有中心體或是微管組織中心(microtubule-organizingcenters)的存在跡象。此實驗結果與微管染色一致，皆顯示A.nasoniae會抑制母系遺傳的中心體生成。ŠA.nasoniae的雄殺機制是透過抑制母系遺傳中心體的生成，而非針對下游的雄性性別決定因子N.vitripennis此一物種有種十分特別的自私基因，稱為父系性比超數染色體(paternalsexratio(PSR)supernumerarychromosome)，讓我們簡稱它PSR。PSR染色體經由精子攜帶，並且會破壞同一精子中其他所有的染色體，也就是說與攜帶PSR的精子結合所產生的受精卵最後會發展為單倍體，也就是雄性[6]。如果A.nasoniae的雄殺機制的確是針對母系遺傳的中心體，而非針對其他下游的雄性性別決定因子，那麼帶有PSR染色體的受精卵雖然為雄性，但其帶有精子提供的中心體，理論上雄殺作用應會被破除。由實際的實驗數據(表三)可得到兩個結論：(1)攜帶PSR的受精卵產生的子代的確偏向雄性，(2)帶有PSR的雄性子代存活率為百分之百。綜合以上結果，作者成功建立A.nasoniae針對母系遺傳中心體的雄殺機制。參考文獻1.S.R.Bordenstein,F.P.O'HaraandJ.H.(2001).Wolbachia-InducedIncompatibilityPrecedesOtherHybridIncompatibilitiesinNasonia.WerreninNature409,No.6821,707–710.2.Werren,J.H.,Skinner,S.W.,andHuger,A.M.(1986).Male-killingbacteriainaparasiticwasp.Science231,990–992.3.Ferree,P.M.,McDonald,L.,Fasulo,B.,andSullivan,W.(2006).Theoriginofcentrosomesinparthenogenetichymenopteraninsects.Curr.Biol.16,801–807.4.Kose,H.,andKarr,T.L.(1995).OrganizationofWolbachiapipientisintheDrosophilafertilizedeggandembryorevealedbyananti-Wolbachiamonoclonalantibody.Mech.Dev.5,275–288.5.Tram,U.,andSullivan,W.(2000).Reciprocalinheritanceofcentroso