4罗氏电化学发光原理

电化学发光免疫分析原理杨明忠12/2014•免疫检测技术的发展•电化学发光系统及其原理•电化学发光技术的优势•免疫检测技术的发展•电化学发光系统及其原理•电化学发光技术的优势技术创新领先的免疫检测新技术－ECL放免酶免荧光免疫化学发光电化学发光1960‘S1970~80‘S2000‘S1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变2，从手工操作向全自动分析仪的转变3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法（RIA），大大提高了免疫测定的敏感度，这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域。缺点半衰期短，试剂货架期不长。标记物不断变化，试剂批间、批内变化大，标准曲线不能保存。反应时间长，操作步骤很难自动化。使用放射性核素，对人体有一定的危害性。分析的限度为10mol/ml或10g/ml。在一定时期内曾被采用，正在被逐步取代。放射免疫测定法1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。酶免疫测定法缺点试剂制备困难。操作步骤复杂，耗时长。影响因素多，质量控制难以保证。最后测定的是颜色的光密度，其精密度和敏感性不如发光免疫技术。各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初。由于最后测定的是光子的量，不但对检测者无害，其敏感度和精密度均优于RIA，而且试剂较稳定，并可进行全自动分析。化学发光免疫测定法采用标记催化酶（如辣根过氧化物酶）或化学发光分子（如鲁米诺）的方法，其化学反应一般不稳定，为间断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。检测时需对结合相与游离相进行分离，操作步骤多。反应原理相对落后。缺点电化学发光免疫技术电化学发光免疫测定法（ECLIA）发展于1996年，它在发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免疫、化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术，是电化学和免疫测定相结合的产物。世界公认的最先进的临床免疫检测技术•免疫检测技术的发展•电化学发光系统及其原理•电化学发光技术的优势Elecsys系列全自动免疫分析仪1996年德国宝灵曼公司推出Elecsys2010系统世界上第一台应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪1998年罗氏公司收购宝灵曼公司2001年罗氏推出电化学发光免疫模块E170罗氏是全球唯一应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商2006年罗氏推出电化学发光免疫模块e6012007年罗氏推出电化学发光免疫模块e411ECL2010diskE170ECL2010racke601Elecsys系列全自动免疫分析仪e411diske411rack电化学发光反应的原理三联吡啶钌和三丙胺在电极表面发生的电化学发光反应电化学发光原理底物：三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3]N羟基琥珀酰胺酯(NHS)三丙胺(TPA)在电极阳极表面，以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧化反应，2价的[Ru(bpy)2+3]标记物被氧化成3价的[Ru(bpy)3+3]的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*，TPA+*很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA*，其为强还原剂，将一个电子给3价的[Ru(bpy)3+3]，使其成为激发态的Ru(bpy)2+3，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的Ru(bpy)2+3。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子。使得光信号增强。SandwichPrinciple双抗夹心法largemolecularweightantigensaremeasureddirectlyproportionalmeasurement,means:lowsignal=lowconcentrationhighsignal=highconcentratione.g.TSH,CA15-3II–assays双抗夹心法&桥联免疫法CompetitivePrinciple竞争法smallmolecularweightantigensaremeasuredindirectlyproportionalmeasurement,means:highsignal=lowconcentrationlowsignal=highconcentratione.g.T4,FolateII–assaysTPAECLCONCENTRATIONSIGNAL(LIGHT)TPAANTIGENBIOTINYLATEDANTIGENRUTHENIUMLABELLEDANTIBODYSTREPTAVIDIN-COATEDMICROPARTICLETRIPROPYLAMINEFIRSTREACTIONSECONDREACTIONLIGHTREACTIONCOMPETITIVEPRINCIPLEMAGNETICFORCE&ELECTRICALPOTENTIAL竞争法电化学发光免疫系统核心原理电化学发光磁性微粒子固相亲和素-生物素间接包被流动池检测系统简单试剂管理，先进的定标概念•直径最小–2.8um•表面积大而均一•磁性微粒子呈悬浮状态•使异相反应变成类均相反应•加快反应速度•提高反应灵敏度磁性微粒子固相载体的优点专利的链霉亲和素-生物素包被技术适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖等。亲和素包被微粒子高效、均一、稳定、通用。链霉亲和素-生物素间接包被的优势生物素结合物与标本液相反应。生物素-亲和素反应亲和力强。由磁铁将结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒（结合相）吸附于电极上，游离相被缓冲液冲走；电极表面的电化学发光的信号检测完成后，磁铁移走并使用系统清洁液冲走电极表面的结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒子；实现了结合相与游离相的全自动分离流动池检测系统简单的试剂管理适用于电化学发光全自动免疫分析仪各种型号Elecsys2010andtheModularE1702维条形码自动输入全部信息试剂联体包成分独立稳定好无需配制，打开即用自动开闭试剂瓶盖，有效地防止挥发等电化学发光试剂极为稳定•两点定标，节约成本•二维条码系统，信息量大先进的两点定标方式·罗氏研发部：建筑在参考标准上的Mastercalibratorcurve：10-12point·每批试剂：Lot-specificmastercalibrationcurve(n=5or6)·客户端：换批号两点定标•免疫检测技术的发展•电化学发光系统及其原理•电化学发光技术的优势同行业中最先进的分析原理专利的电化学发光分析技术（ECL）最好的化学发光标记物-三联吡啶钌分子量小，结构简单。可以标记于抗原，抗体，核酸等各种分子量，分子结构的物质。从而具有最齐全的检测菜单。三联吡啶钌为水溶性，且高度稳定的小分子物质。保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声干扰。最先进的包被技术采用罗氏公司专利的链霉亲和素-生物素包被技术。链霉亲和素-生物素是最牢固和特异的结合。保证了牢固的包被效果和特异的检测结果。电化学发光技术的优势电化学发光技术的优势特殊的磁性微粒子载体以及分离技术由聚苯乙烯包被的磁性微粒子为载体，直径仅为2.8um。同类型产品最小提供类均相的反应环境，增加反应面积，提高反应速度；保证最终检测结果的高灵敏度；利用磁性分离技术，实现全自动化分析。与其它几种标记免疫测定技术相比，电化学发光具有更多的优点：1.高灵敏度，检测下限达pmol；2.线形范围宽，达7个数量级；3.快速，出第一个结果的时间仅需数分钟；4.应用范围广，可以同样的灵敏度和线性范围检测各种物质，包括DNA；5.试剂稳定，无污染和衰变问题；6.自动化程度高。WeInnovateHealthcare