34酶的提取与分离纯化280

第三章酶的提取与分离纯化电泳（electrophoresis,EP）：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。★第四节电泳一、电泳的基本理论1.原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+-★影响迁移率的因素：颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。电场强度：E越高，v越快。电泳液：pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。★自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。2.电泳的分类★按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。★③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。★3.电泳常用设备（1）电泳仪：提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：★二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。★1.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。★CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺★AcrBis聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）引发剂:光TEMED的存在，可加速聚合。.★凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量比应在30左右。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系★样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质1041～4×1044×104～1×105105～5×1055×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表★2.分离效应PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应连续PAGE★电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。★不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。3.在电场中形成不连续的电位梯度。不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。★三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法。★1.原理：SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。★★未知蛋白质在相同条件下进行电泳，可在标准曲线上求得分子量。2.操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性）1）制胶:（变性：buffer中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。★2）样品制备：a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2-5min，以除去亚稳态聚合。3）加样及电泳：SDS-PAGE:电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。★4）固定及染色a.固定：将凝胶浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白质组分。b.染色：•考马斯亮蓝染色法•银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸－Schiff试剂（糖蛋白）。★四、等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续pI的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。自学第五节酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩1蒸发浓缩图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶★2超滤浓缩超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61酶的超滤浓缩★3吸水剂①胶过滤浓缩利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。★②聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。★4反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。5沉淀法盐析法，有机溶剂法★二、酶的干燥酶的干燥多采用冷冻干燥法。将酶溶液在较低温度下（-10℃到-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。三、酶的结晶结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。★结晶的条件1.酶的纯度:纯度越高越易结晶（50％）2.酶的浓度（恰到好处）:浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3.结晶温度4.溶液pH5.离子强度6.晶核7.结晶时间★第五节纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计1纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异▼调节溶解度：沉淀法▼根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤▼根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳▼根据专一性结合的方法：亲和层析▼其它：吸附层析，疏水层析★2纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。★二、纯化方案的评价1酶活力测定：酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量.是酶催化某一化学反应的能力。★方法：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。★常用的方法：▼化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。▼分光光度法:利用底物和产物光吸收性质的不同。▼量气法:酶促反应中产物或底物之一为气体。▼滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。★常用终止反应方法：▼改变反应最适条件：加酸、碱、加热▼加酶变性剂：5％三氯乙酸★酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。★2蛋白质浓度测定▼紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。▼双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速.缺点：灵敏度差▼酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。▼染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。★3酶的纯化指标纯度提纯倍数回收率常用比活力表示酶的纯度：酶活力（u/ml）比活力＝———————————蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）比活力越高，酶纯度也越好。★提纯倍数=提纯后比活力/提纯前比活力提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。总活力＝酶活力单位数酶液总体积即样品中全部酶活力。★判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。回收率：反映酶的损失情况。提纯倍数：表示方法的有效程度。一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。★4纯化表★提纯倍数:0.6/0.416=1.449.8/0.416=23.6500/0.416=1200比活力:5/12=0.41611/3=3.67364/7=52总活力:5×1000=5000170×10=1700产率(回收率):4800/5000=96%1820/5000=36.4%1500/5000=30%酶浓度:5000/1000=51820/5=3641700/10=170思考题：1PAGE和SDS－PAGE电泳的原理有何区别?应用有何不同?2酶活力酶比活3酶的纯化效率通常采用哪些指标?它们如何计算?