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第五章微生物的生长繁殖和影响因子主要内容：微生物的生长繁殖细菌的生长曲线细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用微生物的生存因子不利环境因子对微生物的影响微生物与微生物之间的关系第一节微生物的生长繁殖一、生长繁殖的概念(微)生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物的细胞不断迅速增长，细胞长到一定程度时，就会由一个细胞分裂成细胞。当发生个体数目的增加时，就称为繁殖。单细胞生物的生长和繁殖裂殖、芽殖、孢子繁殖等多细胞生物的生长和繁殖生长：个体体积的增加繁殖：个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。细菌太小，往往讨论其群体生长。世代时间：单细胞微生物的世代时间：两次细胞分裂之间的时间多细胞生物的世代时间：两次繁殖之间的时间世代时间的大小反映了一种微生物繁殖速度的快慢。不同种的微生物，其生长繁殖速度不同。原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快。从一般应用的角度，对于单细胞生物（如细菌），我们常常把生长=繁殖。二、研究微生物生长的方法由于微生物个体太小，难以研究单个微生物，多数是通过培养研究其群体生长。常用的培养方法有：分批培养和连续培养。（一）分批培养分批培养是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖；结果会出现微生物数量由少变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。用于培养微生物的摇床一般摇床都可以控制转速和温度生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。微生物的生长曲线，可以细分为六个时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、稳定期和衰亡期.也可以粗分为四个时期（比较常用）包括：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期细菌的生长曲线下面按四个时期分别进行介绍。1．停滞期（lagphase）细胞分裂之前的准备，适应环境。将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。少量细菌刚接入一定量的新鲜液体培养基中，并不立即生长繁殖，需要有一个适应过程（产生适应酶）。此时细胞物质开始增加，但数量不增加或增加很少。延缓期特点：细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。停滞的长短取决于某些因素：接种量、菌龄、营养等。如果种量大、菌龄小、营养和环境条件好，则停滞期就短。减少迟缓期时间措施：（1）遗传学方法改变种的遗传特性（2）用对数生长期的做种子（3）接种前后培养基成分不要相差太大（4）适当扩大接种量2.对数生长期（logphase）这时的细菌代谢活性、酶活性稳定且高；大小一致；生活力强；用做种子和实验材料。细菌的生长速度达到最大，细菌数以几何级数增加，在生长曲线上呈直线关系。处于对数期的细菌，得到丰富的营养，代谢活力最强，细菌旺盛生长。此时的细菌比较整齐（群体内比较一致）健壮。对不良环境条件的抗性也比较强。第一节微生物的生长繁殖(续）计算世代时间G:已知：t1、t2、X1、X2，X2=X12nn=3.31(lgX2-lgX1)由G=(t2-t1)/n可得：G=(t2-t1)/[3.31(lgX2-lgX1)]另一种方法是假设：dX/dt=K1X其中K1为微生物的生长速度常数ln(X2/X1)=K1(t2-t1)令X2=2X1，则t2-t1=G代入，得：G=ln2/K1即G=0.693/K13.稳定期（stationaryphase）生长率为0，菌数最多并维持稳定，积累代谢产物的好时期。由于对数期的细菌迅速生长繁殖，消耗了大量的营养物质，同时代谢产物的大量积累对细菌本身产生毒害作用；另外，pH、溶解氧、氧化还原电位等条件也变得不利。结果造成细菌的生长速率逐渐下降，甚至到零。在静止期，细菌总数达到最大，新生数与死亡数大致相等，保持动态平衡。此时的细菌开始积累贮存物质，芽孢菌形成芽孢。对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段：1）开始储存糖原等内含物；2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物；调节pH、调节温度；对好氧菌增加通气、搅拌或振荡4.衰亡期（deathphase）营养物质被耗尽，细菌进入内源呼吸阶段（微生物消耗自身的贮存物质进行呼吸）。有害物质大量积累，不利于细菌的生长繁殖，此时，死亡率增加，活菌数减少。细菌常出现畸形或衰退型。特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应从根本上说，细菌的不同生长时期，是由外界提供的营养物的量决定的，即所谓的负荷（F/M）。采取一定措施使微生物以恒定比生长速率生长并持续。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。（二）连续培养dNdt=μN菌数增加速率dNdt=DN菌数减少速率D：稀释率，即培养基每小时流过培养容器的体积数μD，细菌数会增加，营养物消耗和代谢产物积累导致细菌停止生长。μ＝D，维持平衡μD，菌被稀释连续培养两种类型：恒化器连续培养、恒浊器连续培养恒化：某种营养物质维持恒定恒浊：菌恒定1．恒浊连续培养——是一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。按试验目的，首先确定培养液的浊度保持在某一恒定值上。调节进水(含一定浓度的培养基)流速，使浊度达到恒定(用自动控制的浊度计测定)。当浊度较大时，加大进水流速，以降低浊度;浊度较小时，降低流速，提高浊度。发酵工业采用此法可获得大量的菌体和有经济价值的代谢产物。恒浊器连续培养连续发酵优点：缺点：一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化2．恒化连续培养——是维持进水中的营养成分恒定(其中对细菌生长有限制作用的成分要保持低浓度水平)，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌处于或低于最高生长速率状态的培养方式。在连续培养中，微生物的生长状态和规律与分批培养中的不同。它们往往处于相当分批培养中生长曲线的某一个生长阶段。恒化器连续培养恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，作为限制性因子，而其他营养物均过量。限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如aa和氨等氮源，或G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定细菌生长速率。生物反应器（用于微生物的连续培养或分批培养，可以控制温度、溶解氧、pH等多项指标）三、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用在污水生物处理过程中，如果条件适宜，活性污泥的增长过程，与纯种单细胞微生物的增值过程大体相仿，也可以存在停滞期、对数期、静止期和衰老期。但由于活性污泥是多种微生物的混合群体，其生长受废水性质、浓度、水温、pH、溶解氧等多种环境因素影响，因此，在处理构筑物中通常仅出现生长曲线中的某一、二个阶段。且处于不同阶段时的污泥，其特性有很大的区别。由于废水生物处理（活性污泥）实际是连续运行，其微生物生长规律不同于分批培养时的规律，它只能是处于生长曲线的某一阶段。一般把活性污泥生长曲线的划分成三个阶段：生长上升阶段、生长下降阶段和内源呼吸阶段。对于常规活性污泥法，是利用静止期（生长下降阶段）的微生物，这时因为：对数期的微生物生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中的有机物，但是相应地要求进水有机物浓度要高，而出水有机物浓度也相应提高，不易达到排放标准；又因为对数期的微生物生长旺盛，没形成荚膜和粘液层，不易形成菌胶团，沉淀性能差，降低出水水质。而处于静止期的微生物虽然代谢活力略低，但仍能较好地去除水中的有机物，且微生物体内积累了大量的贮存物，形成荚膜等，强化了微生物的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力强，在二沉池泥水分离效果好，出水水质好。当然也有利用其他阶段微生物的废水生物处理方法，如高负荷活性污泥法是利用对数期（生长上升阶段）和减速期（生长下降阶段），延时曝气法是利用衰亡期（内源呼吸阶段）等等。微生物代谢速率与负荷的关系四、微生物生长量的测定方法大致有以下几种：1.测定微生物总数如计数器直接计数，或测定菌浊液的光密度值等。2.测定活细菌数平板菌落（CFU）计数、薄膜过滤计数等。3.计算生长量测定细胞干重，测定某一组份（如含氮量、DNA）或生理指标。1、稀释平板计数法对样品进行适当稀释→单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖→肉眼可见的菌落→对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数以数量变化对微生物生长情况进行测定2、涂布平板法使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）以数量变化对微生物生长情况进行测定同一稀释度三个以上重复,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌3.显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。以数量变化对微生物生长情况进行测定每ml原液含菌数＝每小格平均菌数×400×1000×稀释倍数显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；以生物量为指标测定微生物的生长1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准2、重量法•以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；•通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法以生物量为指标测定微生物的生长3、生理指标法呼吸强度耗氧量酶活性与其群体的规模成正相关生物热样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。以生物量为指标测定微生物的生长第二节微生物的生存因子环境对生长影响1.营养物质2.水活性3.温度影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度4.pH5.氧微生物除需要营养外，还需要合适的环境生存因子。如果环境因子不正常，会造成微生物生命活动不正常，甚至变异或死亡。一、温度影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度微生物的生长要求有一定的温度范围：最低温度、最适温度、最高温度。根据细菌最适温度的不同，可把细菌分为：嗜冷菌（5-10℃）、嗜中温菌（25-40℃）、嗜热菌（50-60℃）和嗜超热菌（70-105℃）。大多数菌为嗜中温菌。不同微生物对温度的要求不同，同一微生物在生长的不同时期对温度的要求也会不同。第二节微生物的生存因子温度对微生物的影响二、pH微生物的生命活动、物质代谢与pH有密切关系。不同微生物对pH的要求有不同。微生物对pH的要求也存在最高、最低和最适三个点。常见的四大类微生物中，对pH的最适（范围）要求分别是，细菌：6.5-7.5（4-10）；放线菌：7-8（5-10）；霉菌：3-6（1.5-10）；酵母菌：5-6（1.5-10）。在废水生物处理中，pH一般在6.5-8.5（6-9）。生物处理的主体是细菌，它要求pH略为