生物化学实验--Folin-Wu法定量测定

Folin-Wu法定量测定血糖的含量1.氧化供能2.人体的主要组成成分之一糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代谢紊乱→供能障碍→一系列代谢变化糖的重要生理功能：血糖及血糖水平的概念：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：3.9∽6.7mmol/L血糖的来源和去路血糖测定的目的和意义临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖水平异常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。症状＋随机血浆葡萄糖≥11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦糖尿病的诊断标准血糖的测定方法测定方法酶法：（1）己糖激酶法（HK）（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵无机化学法：Folin-Wu法，特异性差有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多•掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。•学会制备无蛋白血滤液。•掌握7200型可见分光光度计的使用方法。一、目的要求二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。Cu2+(CuSO4)+葡萄糖Cu+（Cu2O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝。Cu2O+酸性钼酸试剂蓝色钼化合物OD420比色血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。三、实验仪器1、25mL血糖管×3支；2、血糖管橡胶塞×3个；3、沸水浴小锅×1个；4、100mL锥形瓶×2个；5、电炉×1个；6、滤纸×1盒；7、吸耳球×2个；8、7200型分光光度计×1台;血糖管7200型分光光度计1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）•(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。•(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液•A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.•B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。•临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。四、实验试剂5、酸性钼酸盐溶液：•称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。•置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。四、实验试剂1、无蛋白血滤液的制备：•用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。•再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/LH2SO41-2滴）。•用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤2、血糖的定量测定：•取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。•然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。•一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0×C0÷0.1×100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数;C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=样品液光吸收值;A0=标准液光吸收值0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血六、结果计算：空白管标准管（A0）样品管（A1）OD4200OD4200OD4200OD平均0七、思考题•实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？•实验中，血糖管有什么作用？•实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？注意事项：1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10％硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。五、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水7ml摇匀10%钨酸钠1ml摇匀0.33mol/LH2SO41ml边加边摇,加毕充分摇匀放置5—15分(沉淀变为暗棕色)(如不变色,再加0.33mol/LH2SO41~2滴)干滤纸过滤无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血)20ml锥形瓶溶血(变为红色透明)用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：1号管2ml蒸馏水2ml新配制的碱性硫酸铜溶液同时置于沸水浴中8min，取出在流水中迅速冷却4ml酸性钼酸盐溶液一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀用7220分光光度计在420波长处比色,以空白管调节零点2号管2ml标准葡萄糖液3号管2ml无蛋白血滤液m=OD1/OD2×C×10×100分光光度计的工作原理朗伯-比尔定律朗伯定律：A=k1L比尔定律：A=k2C朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC朗伯-比尔定律应用A标=KC标LA样=KC样L标准品法测定未知样品含量C样=A样A标×C标7200型分光光度计的操作程序•连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。•接通电源，使仪器预热20分钟。•用MODE键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。•用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。•将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。•将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0”•按MODE键选择A模式•将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。•当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗→蒸馏水漂洗2次→待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。光面毛面若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。容量的2/3比色皿的光面要与光源在一条线上。光透过窗口