生物化学第二章

生物化学：第二章蛋白质化学华中师范大学生命科学学院第1页共23页1第二章蛋白质化学蛋白质Protein来自希腊文Proteios.原意是第一或昀重要的意思。1938年，Berzlius和Mulder昀先提出。——所有动植物体中发现的含N有机物叫蛋白质蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体昀基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。主要内容：介绍蛋白质的构件单位——氨基酸的结构、分类、性质及肽的概念。重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构与功能的关系。重点：1）氨基酸的性质——两性解离及等电点2）蛋白质的一级结构的测定3）蛋白质的二级结构的要点4）蛋白质结构与功能关系5）蛋白质、氨基酸分离的原理和方法难点：两性解离及等电点；蛋白质的一级结构的测定；蛋白质分离的原理和方法本章讲授内容第一节蛋白质通论第二节蛋白质的基本单位──氨基酸第三节蛋白质的共价结构和肽第四节蛋白质的三维结构第五节蛋白质的结构与功能的关系第六节蛋白质的重要性质第一节蛋白质通论一、蛋白质的重要性二、蛋白质的化学组成三、蛋白质的分类四、蛋白质的大小和分子量五、蛋白质的构象及结构的主要层次六、蛋白质的功能多样性一、蛋白质的重要性（一）蛋白质是生物体的重要组成成分——结构物质人体干重的45%，肝57%，肺82%。植物种子15-40%细菌50-80%病毒则只有蛋白质和核酸（二）蛋白质是生物功能物质1.催化作用——酶；淀粉酶水解馒头2.代谢调节——激素、酶；如胰岛素调节血糖。生长素、促卵泡激素、促甲状腺激素等。3.收缩运动——肌动蛋白；4.运输功能——血红蛋白和肌红蛋白运输O2；脂蛋白运输脂类等。5.贮藏蛋白——植物种子；6.保护作用——毛发、指甲；7.免疫防护功能——抗体、补体、干扰素及昆虫体内的毒素等具有防御功能。8.接受和传递信息、控制生长和分化。9.生物膜功能。二、蛋白质的化学组成（一）元素组成常量元素:C、H、O、N、S、P；微量元素：Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等。生物化学：第二章蛋白质化学华中师范大学生命科学学院第2页共23页2蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳52％，氮16%，氢7％，硫0—3％，氧23％，磷0.6%。（二）蛋白质的含氮量恒定氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数×6.25测定含N量的方法很多，常用的有凯氏定N法、亚硝酸法等三、蛋白质的分类四、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大，从大约6000—1X106或更大，一般为1万至几百万道尔顿。蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（图C兔肌糖原磷酸化酶的模式图）五、蛋白质结构的主要层次一级结构（primarystructure）二级结构（secondarystructure）：α－螺旋体、β－折叠片超二级结构（supersecondarystructure）结构域（Structuredomain）三级结构（Tertiarystructure）四级结构（quariernarystructure）六、蛋白质的功能多样性蛋白质是生活细胞内含量昀丰富、功能昀复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学昀基本的命题。生物体昀主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能......第二节蛋白质的基本单位─氨基酸一、蛋白质的水解二、氨基酸的结构通式三、常见氨基酸的分类及结构四、不常见的蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸五、氨基酸的性质六、氨基酸分析根据分子形状分类球状蛋白质纤维状蛋白质活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、受体蛋白）根据功能分类非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）结合蛋白质简单蛋白质根据组成分类生物化学：第二章蛋白质化学华中师范大学生命科学学院第3页共23页3一、蛋白质的水解根据水解程度：完全水解氨基酸混合物不完全水解大小不等的肽和氨基酸根据水解方法酸水解：多数氨基酸稳定，不引起消旋作用；Trp完全被破坏，羟基氨基酸部分分解，Gln和Asn的酰胺基被水解下来。碱水解：Trp稳定；多数氨基酸被不同程度破坏，且产生消旋现象，Arg脱氨。酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但需多种酶协同作用。1.酸水解条件:常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸，在105-110℃水解，反应时间约20小时。优点：不容易引起水解产物的消旋化。缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸；有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解成羧基。近年来，采用甲基磺酸(CH3.SO3H)代替盐酸水解蛋白质。它不会引起色氨酸的破坏。2.碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。优点是色氨酸在水解中不受破坏。3.酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。优点:不破坏任何氨基酸缺点:水解不彻底昀常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶（后面会详细讲）二、α-氨基酸的通式什么是手性碳原子？手性碳原子有何特征？（1）构型（2）光学活性构型（configuration）构型指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。构型——通过共价键断裂变化形成的立体结构形态。构象——通过单键旋转而形成的一种立体结构形态。1、每种氨基酸都有D型和L型两种立体异构体（甘氨酸除外）2、氨基酸的构型参照甘油醛的构型而确定。与D-甘油醛构型相同的氨基酸为D-氨基酸，与L-甘油醛构型相同的氨基酸为L-氨基酸。书写时，-NH2在左边为L-型，-NH2在右边为D-型。这种由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起光学活性的立体结构叫作构型。蛋白质中的氨基酸除甘氨酸外都具有不对称的碳原子，所以都有L-型和D-型两种构型，但天然蛋白质中存在的氨基酸都是L-氨基酸。3、天然蛋白质中氨基酸绝大多数都是L—型的。近年才发现在某些微生物蛋白质中有Ｄ－型氨基酸。如短杆菌肽S含有D-Phe。生物化学：第二章蛋白质化学华中师范大学生命科学学院第4页共23页4在实验室有机合成的AA为D型和L型，氨基酸放置时间久了，变型LD。4、构型与旋光方向不是一回事，二者无直接对应关系。由于氨基酸分子中含有不对称碳原子，所以具有旋光性。左旋用（－），右旋用（+）。各种L型AA有的为右旋，有的为左旋。即使同一种L型AA，在不同溶剂中测定时，其比旋光值和旋光方向也会不同。三、常见氨基酸的分类、结构——二十种四、生物体内的氨基酸类别蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸。（从各种生物体内发现的氨基酸已有200多种，但是参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有20种。）稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。五、氨基酸的性质1.一般物理性质2.两性性质和等电点——（重点、难点）3.光学活性和光谱性质4.重要化学反应与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（Sanger反应）:用于蛋白质N-端测定.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）：用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定成肽反应：氨基酸合成肽的反应基础1.一般物理性质无色晶体：各种氨基酸都有特殊的晶形熔点极高：一般在200—300℃，比相应的羧酸和胺要高的多。如GlyTm为232℃，相应的乙酸仅16.5℃2.两性性质（1）AA是两性电解质；（2）AA的-COOH和–NH2的离解度受的pH影响据R基团极性分类非极性R基团AA极性R基团AA带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）据R基团化学结构分类据营养学分类杂环ＡＡ(His、Pro)芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)必需ＡＡ人的必需氨基酸：Met、Trp、Lys、Val、Ile、Leu、Phe、Thr、Arg、His非必需ＡＡ不带电荷（７种）一氨基一羧基ＡＡ据氨基、羧基数分一氨基二羧基ＡＡ二氨基一羧基ＡＡ生物化学：第二章蛋白质化学华中师范大学生命科学学院第5页共23页5（3）等电点；（4）各种AA都有各自的pI如Gly5.97,Lys9.74,Ala6.02,Glu3.22（5）等电点与pH中性；（6）AA在pI时,溶解度昀低,昀容易沉淀；（7）等电点的计算氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）pHpI净电荷为正pH=pI净电荷=0pHpI净电荷为负当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点。等电点的计算K1=[R±]·[H+]/[R+][R+]=[R±]·[H+]/K1K2=[R-]·[H+]/[R±][R-]=K2·[H+]/[R±]当pI时，[R+]＝[R-]K1K2＝[H+]2方程两边取负对数：-lg[H+]2＝-lgK1-lgK2则2pH＝pK1＋pK2pH=pI=1/2·(pK1＋pK2)如：GlypI=1/2·(2.34+9.60)=5.97甘氨酸滴定曲线一氨基一羧基AA的等电点计算：pI＝（pK´1+pK´2）/2谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算一氨基二羧基AA的等电点计算：pI＝（pK´1+pK´2）/2二氨基一羧基AA的等电点计算：pI＝（pK´2+pK´3）/23.氨基酸光学活性和光谱性质（1）旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。（2）紫外吸收光谱：参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带，昀大光吸收（lmax）分别为280、275、和257nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。（3）核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）波谱：原子核带有正电荷，只要自旋量子数不等于零，其行为就象饶轴自旋的小磁体，因而能与外加磁场相互作用，产生核磁共振。例如3H、2H、13C、14N、32P的核都属于这一类。氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，