生物化学实验技术操作指导

生物化学实验技术操作指导天津科技大学生物化学课程组2006.12目录生物化学实验须知2实验室一些常用知识介绍3实验一：离子交换法分离氨基酸7实验二：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质9实验三：马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验13实验四：碱性蛋白酶活力的测定16实验五:植物组织中DNA和RNA的提取和鉴定19实验六：糖酵解中间产物的鉴定22实验七：综合设计实验—蛋白质的制备及其含量测定24实验八：还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸法）35实验九：发酵过程中无机磷的利用37实验十：氨基酸的分离鉴定—纸层析法39实验十一：细菌血栓溶解酶活性测定41实验十二：可溶性糖的硅胶G薄层层析43实验十三：植物材料中总黄酮的提纯与鉴定44实验十四：IEF/SDS-PAGE双向电泳分离鉴定蛋白质45附录49一、实验室主要仪器使用操作规程与注意事项49二、常用缓冲溶液的配制55三、硫酸铵饱和度的常用表60生物化学实验须知1．实验室规则(1)实验课必须提前5分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。(2)使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约,应特别注意保持药品和试剂的纯净,严防混杂污染。(3)实验台、试剂药品架必须保持整洁,仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐,仪器洗净倒置放好,实验台面抹拭干净,经教师验收仪器后,方可离开实验室。(4)使用和洗涤仪器时,应小心谨慎,防止损坏仪器。使用精密仪器时,应严格遵守操作规程,发现故障应立即报告教师,不要自己动手检修。(5)在实验过程中要听从教师的指导,严肃认真地按操作规程进行实验,并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告,由课代表收齐交给教师。(6)仪器损坏时,应如实向教师报告,真填写损坏仪器登记表,然后补偿一定金额。(7)每次实验课安排同学轮流值日,值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。2．实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。3．实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果,写出实验报告。（1）标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。（2）实验目的（3）实验原理应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。（4）操作步骤操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。（5）实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。（6）讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。4．生物化学实验课评分标准实验预习情况（10%）实验操作情况（20%）实验报告情况（30%）实验考试成绩（40%）实验室一些常用知识介绍一．玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂1.玻璃仪器的洗涤（1）新购买的玻璃仪器,首先用自来水洗去表面灰垢,然后用洗衣粉刷洗,自来水冲净后,浸泡在1%~2%盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后,用自来水冲洗干净,并用蒸馏水冲洗2次。（2）对于使用过的玻璃仪器,应先用自来水冲洗,再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分冲洗后再用蒸馏水冲洗2次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠,否则表示尚未洗净,需重新洗涤。（3）比较脏的仪器或不便刷洗的仪器,使用前应用流水冲洗,以除去粘附物,如果仪器上有凡士林或其他油污,应先用软纸擦除,再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干后,放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗,再用蒸馏水冲洗2次。（4）普通玻璃仪器可在烘箱内烘干,但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等不能加热,应晾干备用。另外,分光光度计中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成,受热后会散架,所以也不能烘干。对疑有传染性的样品(如肝炎病人的血清),其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或放射性同位素物质的容器,应先经过专门处理后再清洗。2.一些常用的洗涤剂a.肥皂水或洗衣粉溶液这是最常用的洗涤剂,主要是利用其乳化作用以除去污垢,一般玻璃仪器均可用其刷洗。b.铬酸洗液(重铬酸钾一硫酸洗液)铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤,其清洁效力来自于它的强氧化性(6价铬)和强酸性。铬酸洗液具有强腐蚀性,使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次,如洗液由红棕色变为绿色或过于稀释则不宜再用。c.5%~10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液:加热煮沸,利用ED-TA和金属离子的强配位效应,可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。d.45%的尿素洗液:是蛋白质的良好溶剂,适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。e.乙醇一硝酸混合液用于清洗一般方法难于洗净的有机物,最适合于洗涤滴定管。二．生物化学常用缓冲液1.磷酸盐缓冲液磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂,由于它们是二级解离,有2个pka值,所以用它们配制的缓冲液,pH范围最宽：NaH2P04：pKa1=2.12,pKa2=7.21Na2HP04：pKa1=7.21,pKa2=12.32配酸性缓冲液：用NaH2P04,pH值为1~4。配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐,pH值为6~8。配碱性缓冲液：用Na2HP04,pH值为10~12。磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液;②适用的pH范围宽;③pH受温度的影响小;④缓冲液稀释后pH变化小,如稀释10倍后pH的变化小于0.1。其缺点为：①易与常见的Ca2+、Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀;②会抑制某些生物化学过程,如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。2.Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多,有超过磷酸盐缓冲液的趋势,如在SDS-聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用Tris缓冲液,而很少再用磷酸盐。Tris缓冲液的常用有效pH范围是在中性范围,例如Tris-HCl缓冲液pH值为7.5~8.5Tris-磷酸盐缓冲液pH值为5.0~9.0Tris-HCl缓冲液的优点是：①因为Tris碱的碱性较强,所以可以只用这一种缓冲体系,配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液;②对生物化学过程干扰很小,不与钙离子及重金属离子发生沉淀。其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大,缓冲液稀释10倍,pH值的变化大于0.1;②温度效应大,温度变化对缓冲液pH值的影响很大,例如4℃时缓冲液的pH值为8.4,则37℃时的pH值为7.4,所以一定要在使用温度下进行配制,室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0~4℃;③易吸收空气中的C02,所以配制的缓冲液要盖严密封;④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用,所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。3.硼酸盐缓冲液常用的有效pH范围是：pH值为8.5~10.0,因而它是碱性范围内最常用的缓冲液,其优点是配制方便,只使用一种试剂,缺点是能与很多代谢产物形成络合物,尤其是能与糖类的短基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。4.氨基酸缓冲液此缓冲液使用的范围宽,可用于pH值为2.0~11.0,例如最常用的有：甘氨酸-HCl缓冲液：pH值为2.0~5.0。甘氨酸-NaOH缓冲液：pH值为8.0~11.0。甘氨酸-Tris缓冲液：pH值为8.0~11.0(此缓冲液用于广泛使用的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液)。组氨酸缓冲液：pH值为5.5~6.5。甘氨酰胺(glycineamide)缓冲液：pH值为7.8~8.8。甘氨酰甘氨酸(glycylglycine〉缓冲液：pH值为8.0~9.0。此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似,也会干扰某些生物化学反应过程,如代谢过程等;②试剂的价格较高。三．pH值的测定测定溶液pH值通常有两种方法,最简便但较粗略的方法是用pH试纸,分为广泛和精密pH试纸两种。精确测定溶液pH值要使用pH计,其精确度可达0.005个pH单位,关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极,即玻璃电极和参比电极,现在它们已淘汰,被两种电极合一的复合电极所代替。玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感,其头部为一薄玻璃泡,内装有0.lmol/LHCl,上部由银-氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时,薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH值,即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度(活度)的变化而变化。参比电极的功能是提供一个恒定的电位,作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极(Hg/HgCl)或银-氯化银电极(Ag/AgCl)。参比电极电位是氯离子浓度的函数,因而电极内充以4mol/LKCl或饱和KC1,以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶,以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。现在pH值测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极,即将它们共同组装在一根玻璃管使用时应注意：(1)经常检查电极内的4mol/LKCl溶液的液面,如液面过低则应补充4mol/LKCl溶液。(2)玻璃泡极易破碎,使用时必须极为小心。(3)复合电极长期不用,可浸泡在2mol/LKCl溶液中,平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中,使用时取出,用洗并冲洗玻璃泡部分,然后用吸水纸吸干余水,将电极浸入待测溶液中,稍加搅拌,读数时电极应静止不动,以免数字跳动不稳定。(4)使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。(5)使用前要用标准缓冲液校正电极,其数据见书后附录,常用的3种标准缓冲液pH值4.00、6.88和9.23(20℃),精度为±0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88的标准缓冲液中,用pH计上的标准旋钮校正pH读数,然后取出电极洗净,再放入pH值为4.00或9.23的标准缓冲液中,用斜率旋钮校正pH读数,如此反复多次,直至二点校正正确,再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。(6)电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时,玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜,不易洗净而干扰测定,此时可用0.1mol/LHCl的lInurnl胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染,可用丙酣浸泡。若电极保存时间过长,校正数值不准时,可将电极放入2mol/LKCl溶液中,40℃加热lh以上,进行电极活化。pH测定时会有几方面的误差：(1)钠离子的干扰：多数复合电极对Na+和H+都非常敏感,尤其是高pH值的碱性溶液,Na的干扰更加明显。例如,当Na+浓度为0.1mol/L时,可使pH值偏低0.4~0.5个单位。为减少Na+对pH测定的干扰,每个复合电极都应附有一条校正