生物工程毕业论文

毕业论文人工化学法全基因合成学生姓名张建良学号2008307040136院系生物工程专业生物制药指导教师二0一一年五月二十日1人工化学法全基因合成张建良湖北荆楚理工学院生物制药专业摘要：人工化学法全基因合成就是在已知DNA序列的情况下，通过设计引物，拉出全长目的片段并将该段DNA序列克隆到特定的载体里，通过菌检验证得出目的基因已经克隆到载体质粒，最后测序得到克隆基因的序列并与已知DNA序列完全相同无突变的过程。全基因合成的方法目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法，这些方法都有一个前提，就是已有文献报道所研究的目的基因的蛋白序列或者基因的序列。1）反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，设计上下游引物，借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，亦即目的基因的双链DNA。2）基因组扩增法：利用基因组抽提试剂盒，可以从细胞、植物、血液、动物组织中直接分离基因组，设计特异扩增的引物，利用抽提的基因组为模版，直接PCR扩增，以获取目的基因。3）人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，或基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中。化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性和不同的实验需求，设计基因序列，提高表达水平。1流程概观已知DNA片段设计引物引物的合pcr扩增PCR得到目的短片段二次pcr目的片段拼接全长TA克隆克隆到目的载感受态细胞转化菌液pcr菌液检测测序对比序列突变修复得到正确结果确定与已知DNA片段一至。22具体操作及各方面注意的事项当我们研究细胞生物学的时候，我们有时会需要研究一些特定的基因所表现的显性或隐性性状，而我们又没有这段基因的现成模板，这时我们就要通过人工合成的方法制备这段特殊的基因。（1）引物的设计与合成我们都知道DNA是双链螺旋状的，是由腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）鸟嘧啶（G）四种碱基，磷酸分子和糖类借由脂键相连组成其长链骨架。这里我们要说下PCR及PCR体系中七大成分即引物、酶、dNTP、模板、缓冲液、阳离子和双蒸水,PCR就是聚合酶链式反应PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，它是用于DNA的胞外复制，可用于在DNA模板的量不够时对其进行复制和特定DNA的制备。DNA的复制是从5＇到3＇进行的，引物（primer）分上游引物（以下简称引物F）即正向引物和下游引物（以下简称引物R）即反向引物，每两条正反引物组成一对。所以在引物设计是都是2的倍数。一般的PCR只用一对引物，全基因合成时看所需的全长大小而定，在120（bp）碱基以下的两条引物就够了。大于120bp的要看全长。一条引物的长度在60bp左右。这里要说明的是在一般的pcr扩增时的引物是15bp到30bp。引物的合成有相关的规则详解可以查《分子克隆实验指南》。引物的合成是用的化学方法合成碱基，碱基的合成在2个工作日左右。（2）PCR拉片段其实这一步可以归到拉全长里的，但是用引物进行拼接全长时，在1200bp就很难拉出来了，1800bp以上的就不可能拉的出来了。所以在比较长的的全基因合成时都会拉小片段。我感觉PCR扩增在200bp——600bp时的扩增效率是最好的，在1200bp以下的全长基本都能直接p出来的，所以就说下bp数较大的全基因。我们可以以6条或8条引物为最小单位来拉片段，首先取每条引物10ul混合在一起标上primermix，以primermix当作模板（template）然后用第1条和第6条引物作为正反向引物在150ul的EPg管中配成pcr体系：3template(primermix)3ulprimerF1ulprimerR1uldntp1ul10*buffer3ulPfuemzqme1ulddwater20ultotle30ul在PCR仪上设置程序：95℃1min95℃18s56℃18s25cycles72℃20s72℃7min4℃forever将以扩好的东西从PCR仪中拿下候，加入5ul的溴酚蓝（染料）并进行电泳，点胶的时候点上看条带大小的maker。跑胶后会有300bp左右的条带，然后切胶回收（）图为500bp。这里介绍一种胶回收试剂盒，试剂盒就是由有操作步骤的说明书和全部配套的实验用品。如我们常用的“S”型试剂盒:试剂有溶胶用的bufferDE-A（红色）,buffered-B（无色）,异丙醇洗脱用的bufferW1，bufferW2还有洗液TE。实验用具有2ml离心管2ml无盖离心管、吸附柱、1.5mlEP管。操作是：切胶放到2ml离心管加入400ulbuffeDE-A置于恒温水浴锅中70℃溶胶20min，溶胶后加入200ulbufferDE-B摇匀溶液变黄，继续加150ul异丙醇摇匀，将混合液转入吸附柱内放在2ml无盖离心管上静置1min，3600转／min离心1min，弃废液加500ulbufferW13600转／min离心1min，弃废液加500ulbufferW23600转／min离心1min（重复一次），转移吸附柱到1.5ml离心管，静置8——10min，加30ulTE12000转／min离心1min，得到的30ul物质即以纯化的pcr产物。（注意：1电泳是用1*的琼脂糖凝胶，里面含有EB是强致癌4物质，要注意戴手套。2胶块不要在紫外下照过长的时间，DNA在紫外下容易发生突变。）（3）全长的拼接全长的拼接就是把得到的段片段当做模板以全长的首末两条引物作为正反引物进行PCR拼接。如果我们得到的有6条小片段，我们可以做这样的体系编号小片段（全长的排列顺序）1#2#3#4#5#6#，体系为1#1ul2#1ul3#1ul4#1ul5#1ul6#1ulfirst-F2ullast-R2uldntp1ul10*buffer5ultaqenzyme1ul5*pcrenhancer10ulddwater23ultotal50ul程序：95℃5min95℃30s58℃30s30cycles72℃2min72℃7min4℃forever电泳跑胶，切1800bp条带，纯化（胶回收）即得到全长。注意：两次PCR体系中在设定退火温度时的不同时因为温度高特异性好时间是根据扩增效率定的。体系中有pfu5聚合酶和taq聚合酶，pfu的保真性高，而taq聚合酶的扩增效率高，之所以像体系中设置，是因为在300bp时要注意保真性而1800以后要提高扩增效率，来提高实验的可行性和稳定性。在这里介绍下2000bp以上的全基因合成方法，在大致上是差不多的，但是2000bp以上的全长是直接拉布出来的，我们就要用先转化片段再做亚克隆的方法做（后面会有介绍）。（4）TA克隆在用taq聚合酶扩增的DNA片段有一个特殊的地方即3′端会多出一个A,5′会多出一个T。TA克隆方法（OriginalTACloningKit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。克隆其实就是一个简单的pcr。下面我举个克隆的例子。体系：pcrproduction7ulvector1ulT4DNAligase1ulT4buffer1ultotal10ul程序：16℃过夜过夜连接时为了连接效果最好，普通的T4连接最少要连接3个小时连接时后面转化成功率的关键。T4连接就是一个线性载体与粘性末端DNA相连成环状的质粒的过程。T-A克隆要注意的事项有，1.这种连接有平端连接和粘性末端连接，平端连接连接效率低，在做体系的时候可以加点50%PEG4000（加强平端连接效率的）末端有粘性的就可以直接连。连接的问多在16-22℃。2.因为要做转化，所以TA克隆时体系要在10ul一下。3，连接配体系的时候要注意插入片段要是载体的的mol量的2-10倍，这样以保证片段的插入几率大。（5）转化转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。细胞处于能够吸收DNA的6状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。感受态细胞是转化的重要成分。在这里介绍一种DH5α菌株制备的感受态的使用方法，DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一，该菌株经过特殊处理而获得高活性的感受态细胞。DH5α感受态的使用方法是：操作方法（注意以下操作均为无菌操作）：①取感受态细胞室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上；②向感受态细胞中加入目的DNA（连接产物），轻轻旋转以摇匀，在冰上放置30分钟；③将离心管取出在水浴锅中42℃热激90s（时间必须严格控制），然后快向离心管中加入900ul无抗的（不含AMP、KAN、CHL等抗性）LB培养基摇匀后37℃水浴或摇床培养1h使细菌恢复正常生长状态并表达质粒编码的抗生素抗性基因；④将离心管取出，5000转／min离心3min，吸掉900ul上清液，将沉下的菌吹匀涂在相对抗性的固体培养基上，待菌液被培养基完全吸收后，37℃培养16—24小时（如果基因上有lacz区域的可以进行篮白筛选，在涂板前在平板上IPTG(10ul)和X-GAL（40ul）。在涂板后16-24小时平板上会长出许多的菌落，可能只有白色的也可能是只有蓝色的，但大多数是蓝白都有，根据实验的需要挑菌。挑菌必须是在超净台上操作（无菌），如果是挑在试管（单管）中，就加对应抗性的液体培养基4ml，如果是挑在48孔板里就每孔加对应抗性的液体培养基2ml。挑菌要用高温高压灭菌好的移液器的枪头，挑菌时尽量避免挑双克隆。挑菌是我们看平板上的菌落，有的菌落是明显的两个菌落长在一起这样的就不要挑，在就是不要挑菌落密集的地方的菌株，要挑哪些比较稀松的地方能够的菌。有的菌落的形状不是圆的或是菌落的菌斑相对特别大的，这样的菌落最好不要挑有可能是双克隆。要挑那些形象圆的菌落大小一般的菌。挑好菌后放在恒温摇床里37℃培养7—12小时3000bp以上的全基因合成，就拿3000来说我们只要拉出1-1600bp和1500bp-3000bp，把这两段分别克隆转化，然后我们1500bp-1600bp这段上找到一个合适的酶切位点比如hindⅢ然后载体上有酶切位点,用hindⅢ、xhoⅠ7酶切转化后的两个片段，回收1-1600bp的载体片段和1500bp-3000bp切下的小片段。将他们当做载体和插入片段进行T-A克隆。并转化测序最后得到我们要的DNA片段。（6）菌检菌检就是菌液检测，其目的就是看看插入片段有没有克隆到载体中。菌检就是扩一个pcr，菌检时我们用的引物大多是用的通用引物，都以用他的通用引物做菌检。菌检体系：菌液5ulprimerF1ulprimerR1ul2*PCRmix15ulddwater8ultotal30ul程序：95℃5min95℃30s58℃30s25cycles72℃2min72℃7min4℃forever注意：pcrmix是一种含有dntp、atp、缓冲液（buffer）、taq聚合酶的有一种混合液。因为菌检的量一般比较大，所以配pcr体系用mix既方便又混合均匀。菌检后将扩增下来的混合液跑胶，看出现比我们克隆的插入片段bp数稍大的条带，取一两个菌进行抽质粒测序。（7）测序测序是为了看我们在转化是插入的片段是不是我们的目的片段。测序的原理