生物技术大实验指导书

生物技术大实验指导书苏州科技学院化学与生物工程学院2007年9月前言生物技术大实验内容覆盖了生物技术的上、中、下游的全过程，包括了微生物技术、基因工程、发酵过程工程、生物分离工程、植物组织培养和酶工程技术等，覆盖生物技术大部分研究领域，使学生得到生物技术实验操作的全程、全方面训练，以提高学生的学习兴趣、动手能力和工作的责任心。实验内容同时将过去简单的验证性实验转变为综合性、设计性实验，旨在实验中提高学生实验设计能力、分析问题、解决问题的能力以及实验数据的处理能力，从而培养和提高学生的实践能力和创新能力。还能大大提高学生对这些热门学科的兴趣，对提高学生的综合素质和创新能力具有重要的作用和意义。为继续深造或参加科研活动打下扎实的基础，为此特提出以下几点要求：一、实验前要认真预习实验指导，熟悉实验内容、方法和具体操作步骤，并对本实验中的部分设计型实验内容进行实验参数设计，写出预习报告。二、实验过程中要认真操作、仔细观察、善于思考和提出问题。作好实验数据及发生现象的记录。三、爱护实验室的一切设备和实验仪器，如有损坏应主动向教师说明原因，并填写报损报废单，以便酌情处理。四、每个小组的学生在进行实验过程中，要密切配合、互相帮助，力争圆满地完成各项实验内容。五、实验室需要保持安静，不允许高声喧哗和谈笑。每次实验结束，应清理自己的实验台，把实验用具清洗完毕，安放妥当。并组织值日生打扫，保持实验室的清洁卫生。六、实验结束后认真整理数据、计算结果，对实验中的现象和问题进行必要的讨论；对改进实验提出合理化建议。目录一植物组织培养技术.........................................................................................-1-实验一培养基母液的配制............................................................................................-1-实验二MS培养基的配制与灭菌............................................................................-4-实验三无菌材料的转接和培养...............................................................................-7-实验四外植体的消毒及其愈伤组织的诱导.........................................................-9-二微生物与环境检测实验...............................................................................-11-三β¡半乳糖苷酶的固定化及应用................................................................-19-四生物分离技术综合实验...............................................................................-25-实验一植物色素的制备................................................................................................-25-实验二植物色素的分离纯化........................................................................................-28-实验三植物色素的定量与初步鉴定............................................................................-31-五林可霉素发酵过程工艺控制.......................................................................-33-六基因工程实验...............................................................................................-37-实验一PCR扩增制备目的基因.....................................................................................-37-实验二从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段.............................................................-39-实验三目的基因片段与载体连接................................................................................-41-实验四感受态菌的制备................................................................................................-43-实验五细菌转化............................................................................................................-45-实验六重组子的筛选....................................................................................................-47-实验七载体质粒DNA的小量制备.............................................................................-49-实验八载体质粒DNA的酶切........................................................................................-51-实验九酶切产物的电泳鉴定........................................................................................-53-七附录Ⅰ......................................................................................................-55-植物组织培养技术常用培养基及消毒剂..............................................-56-八附录Ⅱ......................................................................................................-56-林可霉素发酵过程有关离线参数的分析方法.............................................-57-九附录Ⅲ......................................................................................................-61-分子生物学常用试剂、溶液和缓冲液........................................................-61--1-一植物组织培养技术实验一培养基母液的配制一、目的要求掌握培养基母液的配制方法。二、基本原理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同类型的培养基中使用。三、实验材料电子分析天平、扭力天平、烧杯(50mL、100mL、500mL、1000mL)、量筒、(1000mL、100mL、25mL)、容量瓶(1000mL、500mL、100mL)，磨口试剂瓶(500mL、1000mL)、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉(1000W)、冰箱。配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备（见附录Ⅰ）。植物生长调节物质有2，4－D，NAA，6－BA等。四、操作步骤首先，按本书的附录Ⅰ，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后分别进行药品称取和母液配制。具体操作如下：1．MS大量元素母液的配制按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水大约800mL，放人1000mL的烧杯中，依次分别称取：NH4NO333g、KN0338g、KH2P043.4g、MgS04¡7H2O7.4g、CaCl2¡2H208.8g，按顺序先后倒人烧杯中，用玻璃棒揽动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液-2-倒人1000mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50mL。2．MS微量元素母液的配制将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大l000倍，用分析天平分别依次称取MnSO4¡4H2022.3g、ZnSO4¡7H208.6g、H3BO36.2g、KIO.83g、Na2Mo04¡2H2OO.25g、CuSO4¡5H200.025g、CoCl2¡6H200.025g，并用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000mL的磨口试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制MS培养基时，每配制1000mL培养基吸取此母液1mL。3．铁盐母液的配制在电子天平上准确称取2.78g硫酸亚铁(FeSO4¡7H2O)和3.73g乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)，分别倒人盛400mL蒸馏水烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。将两种溶液倒人同一个1000mL的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000mL，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中，则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制1000mLMS培养基吸取此母液10mL。4．MS有机母液的配制用电子天平依次称取：肌醇(环己六醇)5000mg、盐酸硫胺素(维生素B1)5mg、烟酸25mg、甘氨酸100mg、盐酸吡哆醇(维生素B6)25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500mL的磨口试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4℃冰箱保存备用。配制培养基时，每配制1000mLMS培养基吸取该母液10mL。5．植物生长物质母液的配制由于水剂型的植物生长物质在组织培养中既使用方便，又消毒简单，故在配制培养基前常将常用的植物生长调节物质，如2，4－D、6－BA和NAA等配制成500mg¡L-1浓度的母液。其配制方法如下：(1)．2，4－D母液；准确称量2，4－D50mg，先用1