生物标志物实验ppt-PowerPointPresen

实验四生物标志物实验——水生动物谷胱甘肽转移酶活性测定指导老师：刘汝涛山东大学环境科学与工程学院（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活性影响。（2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。1谷胱甘肽转移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶）是细胞质内催化相Ⅱ反应起解毒作用的重要酶，具有许多同工酶。污染物进入体内经过相Ⅰ反应后，在谷胱甘肽转移酶的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相Ⅰ反应产生的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有多种的跨膜运输机制（如通过ATP推动GS-X泵）能使这类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中，谷胱甘肽结合作用是相Ⅱ反应的主要形式。GSTs催化的一般反应为：GSH+R-X=GSR+HX在该反应中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增加GSH和亲电性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基，诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。存在于所有的动物体内，肝脏是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占可溶性肝蛋白的10％，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝蛋白的主要成分。GSTs能被多种的污染物所诱导，如有机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高1.5～2.0倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导，其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流中，污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量和活性比清洁断面高出3～4倍。然而，研究也发现GSTs活性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响，存在较大的差异。基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水生动物暴露于有机氯农药林丹（Lindane）之后，其体内GSTs酶活性的变化。．器材冷冻离心机（BeckmanCoulter22Rcentrifuge），酶标仪（Bio-TekInstruments，INC）pH计，溶解氧测定仪，电导率测定仪，96孔板，1.5mL离心管，水浴锅，生物冰袋，移液枪（20uL、100uL、1000uL）及对应枪头。2．受试生物成年雄性的钩虾（Gammaruspulex）。从野外采集投放在10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在15℃（±1℃），12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（Cladospuriumsp.）发酵1周的桤木叶（AlnusglutinosaL.）喂食。3．试剂1-氯-2，4-二硝基苯（CDNP），还原性谷胱甘肽（GSH），谷胱甘肽转移酶标准品（GSTs），苯甲基磺酰氟（PMSF），TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚），EDTA。4．溶液的配制（1）林丹储存液取50mg林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成100mg/L的林丹储存液，于4℃下阴暗处密封保存备用。3（2）酶和缓冲液①配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液（PB）利用此磷酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液：（i）组织破碎缓冲液（HB）：含有1.0％TritonX-100（v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液；（ii）冲洗缓冲液（DB）：含有1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液；（iii）空白缓冲液（BB）：含有0.1％TritonX-100（v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液。②100mmol/LPMSF溶液用95％乙醇溶解适量的PMSF，于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存5d。3③40mmol/LCDNB溶液用95％乙醇溶解适量的CDNB，保存方法与PMSF相同。④20mmol/LGSH标准液的配制配制100mmol/LEDTA母液，用0.1mol/LKH2PO4稀释母液至EDTA的浓度为1mmol/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH使其终浓度为20mmol/L。用1mol/LHCl或1mol/LKOH校正pH。于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存5d。⑤酶活测定液实验之前配制，将CDNB和GSH溶液从冰箱中取出，置于室温。取5份的20mmol/LGSH标准液、9份的磷酸缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40mmol/LCDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。3．暴露试验按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在15℃±1℃，光暗比为12h︰12h。实验开始时测定各浓度梯度林丹曝气水的溶解氧，pH和电导率。暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞出来，先用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮罐20s以猝死钩虾。取出的离心管在-70℃保存。4．酶活力的测定将1.5mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩虾20～30min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。4℃下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清移另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。在一个干净的1.5mL的离心管内加入500uL酶活为1.4单位/mL的谷胱甘肽转移酶标准样品，加入500uL的冷的空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀。4标准样品，钩虾组织液上清或者空白缓冲液（BB），每组设四个平行。然后加入150uL酶活测定液，使每个孔内含有200uL的反应液。将96孔板放入酶表仪30℃轻微震荡反应30min，然后充分震荡96孔板以混合各反应液。340nm下每隔1min记录一个吸光值，计算吸光值随时间的变化的斜率。式中：OD为吸光值随时间变化的斜率（OD340/min）；ε为摩尔吸光系数（9600mol-1cm-1）；R为反应系统体积（uL）；S为样品上清的体积（uL）；W为样品蛋白浓度（g/L）；P为样品厚度（0.6cm）。4GST酶活PWR1000ROD．总蛋白的测定以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准液。取0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净的EP管中，加入200uLBio-Rad产品。稀释缓冲液取80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的0.1％的TritonX-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀释混合液至800uL，加人200uLBio-Rad产品。4反应过的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组设三个平行，加入96孔板内。25℃下，摇动96孔板20s后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为牛血清蛋白标准样曲线的斜率。4KOD620蛋白浓度林丹3ug/L林丹6ug/L林丹12ug/L林丹24ug/L各实验组参数溶解氧（mg/L）pH电导率（ms）钩虾死亡个体数(只)0（h）24（h）48（h）．酶活力与蛋白活力的测定试验结果记录曝气水空白溶剂组对照林丹1ug/L林丹3ug/L林丹6ug/L林丹12ug/L林丹24ug/L酶活测定OD340(min)蛋白测定OD620酶活(mol·L·g-1·min-1)