231-移植免疫及其免疫检测

第二十三章移植免疫及其免疫检测第一节引起排斥反应的靶抗原一、主要组织相容性抗原二、其他组织相容性抗原第二节排斥反应的种类及发生机制一、超急性排斥反应二、急性排斥反应三、慢性排斥反应四、移植物抗宿主反应第三节HLA分型一、血清学分型法二、细胞学分型法三、分子生物学分型法第四节常见的组织或器官移植一、肾脏移植二、肝脏移植三、心脏移植与心肺联合移植四、骨髓与其它来源的干细胞移植第五节排斥反应的预防与治疗一、组织配型二、移植物与受体的预处理三、免疫抑制措施思考题小结第六节排斥反应的免疫监测一、体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义二、尿微量蛋白检测的临床意义三、急性时相反应物质检测的临床意义四、免疫抑制剂体内药物浓度检测的临床意义移植（transplantation）是指将健康细胞、组织或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或补偿机体所丧失的结构和（或）功能的现代医疗手段。被移植的细胞、组织或器官称移植物（graft），提供移植物的个体称为供体(donor)，接受移植物的个体称为受体（recipient）或宿主（host）。自体移植同系移植同种异体移植异种移植原位移植根据移植部位分类异位移植器官移植移植物种类分类支架组织移植细胞移植根据移植物来源分类移植的类型移植名称供者、受者关系举例自体移植同一个体自体断肢再植，自体皮片移植同系或同基因移植同系或同基因人的单卵双生子间的器官移植的个体间同品系小鼠的皮片移植同种异基因移植同种不同基因人与人之间的肾移植的个体间不同品系小鼠间的皮片移植异种移植异种动物间狗的器官移植给猩猩猪的器官移植给狗移植种类和命名第一节引起排斥反应的靶抗原主要组织相容性抗原其他组织相容性抗原一、主要组织相容性抗原主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）编码的人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA），是不同个体间进行器官或组织细胞移植时发生排斥反应的主要成分，这种代表个体特异性的同种抗原又称组织相容性抗原(histocompatibility)或移植抗原(transplantationantigen)。父母HLA是人体多态性最丰富的基因系统。据1999年的统计，HLA复合物等位基因总数已达到1031个，其中HLA-B等位基因有301个A9Cw3B7A2Cw2B13A1Cw1B5A3Cw4B8HLA的遗传特征单倍体遗传高度多态性在三类HLA分子中，Ⅰ、Ⅱ类分子是触发移植排斥反应的首要抗原，尤其是HLA-DR位点的抗原分子HLA的识别方式：直接识别间接识别HLA发挥双重作用：介导宿主抗移植物反应(HVGR);参与移植物抗宿主反应(GVHR)。二、其他组织相容性抗原次要组织相容性抗原ABO血型抗原系统组织特异性抗原第二节排斥反应的种类及发生机制移植排斥反应（tranlplantationrefection）是针对移植抗原产生免疫应答，从而导致移植物功能丧失或受者机体损害的过程。排斥反应分类：超急性排斥反应急性排斥反应慢性排斥反应预防措施：ABO血型配型、细胞毒实验一、超急性排斥反应发生机制：受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统,导致血管内凝血。预存抗体来源：1、供受者之间ABO血型不合；2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植处理措施：重新移植发生时间：血循环恢复后的数分钟至1～2天内分类：急性体液性排斥反应：抗体激活补体，并有CD4+T细胞参与，导致急性血管炎急性细胞性排斥反应：CD8+CTL细胞的细胞毒作用、CD4+T和巨噬细胞的作用，导致急性间质炎。二、急性排斥反应发生时间：移植后数周至数月内，是排斥反应最常见的类型处理措施：使用免疫抑制剂①直接途径（directpath）:残留于供者移植物内的抗原提呈细胞（过客细胞）对受者机体的免疫系统提供最初的抗原刺激。这种抗原性刺激，来自移植物中树突状细胞和单核细胞等表面富含的HLA-Ⅰ、-Ⅱ类分子②间接途径（indirectpath）:通过受者体内的抗原提呈细胞对具有同种异基因HLA-Ⅰ、-Ⅱ类分子的移植物实质细胞的识别。无论是供者还是受者，其抗原提呈细胞提供的IL-1、IL-6等刺激信号，有助于触发淋巴细胞的活化急性排斥反应中的两条抗原提呈途径同种移植排斥反应的发生机制三、慢性排斥反应发生时间：一般发生于移植后数月甚至数年临床特征：对免疫抑制疗法不敏感无特异性治疗方法，最终需要重新进行器官移植病理特点：血管壁细胞浸润、间质纤维化和瘢痕形成T细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。B细胞产生的抗体活化补体或通过ADCC破坏血管内皮细胞。急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变，此与细胞和体液免疫均有关系。非免疫相关因素，诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生引起慢性排斥反应的因素定义：在骨髓移植时，供者骨髓中的免疫细胞启动以受者细胞为靶抗原的免疫应答反应，引起攻击受者的移植物抗宿主反应。GVHD也可见于脾、胸腺和小肠移植。四、移植物抗宿主反应发生机制：T细胞起主要作用IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子参与ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等粘附分子参与第三节HLA分型方法HLA分型方法的改进和不断完善，使得HLA复杂的多态性更加显现，亦推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，更促进了人们对疾病本质的认识。一、血清学分型法应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清与待测淋巴细胞混合，借助补体的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。耗时长不同批号抗血清结果常有不同操作简便易行节约试剂、结果可靠、重复性好无需特殊设备用于HLA分型的微量细胞毒试验死（着染）细胞（%）记分结果判断0～101阴性11～202可疑阴性21～504弱阳性51～806阳性808强阳性0未试验或不能读数微量细胞毒试验判定标准HLA分型结果举例二、细胞学分型法以混合淋巴细胞培养（mixedlymphocyteculture,MLC）或称混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereaction,MLR）为基本技术的HLA分型法。能用本法测定的抗原称为LD抗原（lymphocytedefinedantigen）,包括HLA-D、-DP。MLC分为单向MLC和双向MLC将已知HLA型别的分型细胞用丝裂霉素C或X线照射预处理，使其失去增殖能力仅作为刺激细胞；而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时，反应细胞可对刺激细胞发生应答而增殖，用3H-TdR掺入法测定细胞增殖强度，从而判断受检细胞的HLA型别。根据选用的刺激细胞类型分为：1．阴性分型法2．阳性分型法1.单向MLC遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞增殖，故称双向MLC。在此试验中，各自的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞，反应后形态上呈现的细胞转化和分裂现象，可通过形态法计数转化细胞。2.双向MLC本法不能判断型别，只能说明供、受体HLA抗原配合程度三、分子生物学分型法分子生物学技术的迅速发展，使得HLA的DNA分型技术应运而生，并在开展DNA限制性片段长度多态性分析、DNA指纹图、等位基因特异性寡核苷酸杂交等基础上，引入多聚酶链反应技术，使HLA分型得以在更精密的水平上进行。限制性片断长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析：最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术PCR-RFLP分型法：对DNA片段进行体外扩增，然后再用限制性内切酶进行酶切分析，可使限制性长度分析的敏感度大大增加1.RFLP与PCR-RFLP分型法序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-sequencespecificoligonucleotide,PCR-SSO）是以PCR为基础，将凝胶上扩增的HLA基因DNA转移至硝酸纤维膜或尼龙膜，进而用放射性核素或酶、地高辛等非放射性物质标记的寡核苷酸探针与之进行杂交，从而对扩增产物作出HLA型别判断。2.PCR-SSO分型法分类：斑点或印渍法反向斑点或印渍法PCR-SSO是Ⅱ类HLA分型应用最广泛的方法，能够鉴定所有已知序列的HLA-DR、－DQ、－DP等位基因是近年发展起来的一项新技术,将其与PCR-SSO结合应用于HLA分型，可使分型趋于规模化和自动化，尤其在HLA多态性和疾病遗传背景分析等方面更具优势。HLA的基因芯片分型法，实际上是PCR-SSO反向斑点或印渍法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型领域的应用尚属起步阶段。基因芯片(genechip)原理：应用设计的一套HLA等位基因的序列特异性引物（sequencespecificprimer,SSP）,对待测DNA进行PCR扩增，从而获得HLA型别特异性的扩增产物3.PCR-SSP分型法HLA基因扩增的特异性包括：座位特异性（locus-specific），如HLA-A、－B、-DRB1等；组特异性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等；等位基因特异性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。原理：对ssDNA进行无变性剂的聚丙烯酰凝胶电泳时，因其序列的差异可形成不同的空间构象而导致电泳迁移率的差异，如此可分辨出单一碱基的差异和检测出DNA多态性或点突变，有助于新的HLA等位基因或突变体的发现。4.PCR-SSCP分型法单链构象特异性－聚合酶链反应（PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP）是以对待测基因PCR扩增为基础，对扩增的单链DNA（ssDNA）的HLA分型方法。特点：PCR-SSCP作为PCR-SSO的补充，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处，有利于排除SSO杂交的假性。基本过程：分离待测细胞的DNA，应用座位、组或等位基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物的纯化和测序，测出的基因序列与HLA基因库的DNA已知序列比较，判断待测的HLA型别。5.SBT分型法基于序列的HLA分型法（sequence-basedHLAtyping,SBT），通过对扩增后的HLA基因片段通过核酸序列测定来判断HLA型别。第四节常见的组织或器官移植临床器官移植术的建立至今已有50多年的历史。从肾脏移植到心肺移植、肝脏移植；从完整的器官移植到部分组织器官甚至是细胞移植；从单一的器官移植到器官联合移植。一、肾脏移植肾脏移植，创始于1950年，是临床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。由于免疫抑制药物的不断更新和移植技术的不断提高，肾脏移植患者1年和5年的存活率，分别可达90%～95%和80%～90%。组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段包括：ABO血型配型HLA配型交叉配型肾源选择的原则：以ABO血型完全相同者为好，至少能够相容选择最佳HLA配型的供者器官1.组织配型在肾脏移植中的应用临床观测项目:T细胞总数、CD4/CD8比值和IL-2及其受体的检测，判断排斥反应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果肾组织活检，预测排斥反应的发生CsA血药浓度检测，指导合理用药，减少肾毒性2.肾移植受者的疗效检测疗效监测：受者免疫状态检测二、肝脏移植肝脏移植手术已经成为治疗原发性胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝炎后肝硬化、酒精性肝病、肝细胞性肝癌、自身免疫性肝病、急性肝功能衰竭以及药物诱导的肝脏损伤等疾病，挽救晚期肝病患者生命的最有效方法。特点：HLA是否匹配与肝脏移植效果无显著差异机制：肝脏移植时，因HLA不配仅发生较弱的排斥反应，而免疫抑制剂的应用有效控制了排斥反应的发生肝脏移植时仍应尽可能进行HLA配型1.组织配型在肝脏移植中的应用排斥反应发生几率：约2/3的肝移植患者出现过排斥反应的病理学改变，也有8％