电泳技术和常用电泳仪_百替生物

@[e-mail]@[e-mail]第六章第六章第六章第六章电泳技术和常用电泳仪首页基本要求重点难点讲授学时内容提要1基本要求1．了解1.1常用的电泳仪简介1.2电泳仪的技术主要指标1.3电泳技术的分类1.4电泳仪临床应用实例1.2熟悉1.2.1毛细管电泳仪基本工作原理1.2.2毛细管电泳仪的基本结构1.2.3电泳方法简介1.2.4常用电泳仪设备1.3掌握1.3.1电泳基本原理1.3.2影响电泳的外界因素1.3.3毛细管电泳的特点1.3.4毛细管电泳分离模式1.3.5与毛细管电泳相关的基本概念1.3.6电泳技术的质量控制2重点难点2.1重点2.1.1电泳基本原理2.1.2毛细管电泳分离模式@[e-mail]@[e-mail]2.1.3毛细管电泳的特点2.1.4影响电泳的外界因素2.2难点2.2.1电泳方法简介2.2.2毛细管电泳分离模式2.2.3电泳技术的质量控制3讲授学时建议4~6学时4内容提要4.14.14.14.1电泳原理电泳原理电泳原理电泳原理4.1.1电泳基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。若溶液里一电量为Q的带电粒子，在场强为E的电场中以速度υ移动，则它所受到的电场力Ｆ应为：Ｆ＝QＥ（6-1）根据斯托克司定律，在液体中泳动的球状粒子所受到的阻力Ｆ’为：Ｆ’＝6�ηrυ（6-2）式中η为介质的粘度系数，r为粒子半径。当二力平衡，即Ｆ＝Ｆ’时，粒子作匀速泳动，且有υ＝QＥ／6�ηr（6-3）4.1.2影响电泳的外界因素电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用、粒子的迁移率、吸附作用。4.24.24.24.2常用电泳仪的基本结构、工作原理和技术指标常用电泳仪的基本结构、工作原理和技术指标常用电泳仪的基本结构、工作原理和技术指标常用电泳仪的基本结构、工作原理和技术指标4.2.1电泳技术的分类@[e-mail]@[e-mail]电泳技术的分类通常可按照电泳实验条件的某一特征，目前常用分类如根据工作原理、支持载体的位置或形状、有无固体支持物、支持物的特点、电源控制、自动化程度、功能、用法、使用目的分类等来命名。4.2.2常用电泳仪设备通常所说的电泳设备可分为主要设备（分离系统）和辅助设备（检测系统）。主要设备指电泳仪电源、电泳槽。4.2.2.1电泳电源电泳电源是建立电泳电场的装置，它通常为稳定（输出电压、输出电流或输出功率）的直流电源，而且要求能方便地控制电泳过程中所需电压、电流或功率。4.2.2.2电泳槽电泳槽是样品分离的场所，是电泳仪的一个主要部件。槽内装有电极、缓冲液槽、电泳介质支架等。电泳槽的种类很多，如单垂直电泳槽、双垂直电泳槽、卧式多用途电泳槽、圆盘电泳槽、管板两用电泳槽、薄层等电聚焦电泳槽、琼脂糖水平电泳槽、盒式电泳槽、垂直可升降电泳槽、垂直夹心电泳槽、U型管电泳槽、DNA序列分析电泳槽、转移电泳槽等。下图是垂直式电泳槽装置（图6-1）。图6-1垂直式电泳槽装置示意图4.2.2.3附加装置辅助设备指恒温循环冷却装置、伏时积分器、凝胶烘干器等。有的还有分析检测装置。4.3.4.3.4.3.4.3.电泳方法简介电泳方法简介电泳方法简介电泳方法简介电泳技术发展迅速，方法种类繁多，以下简单介绍几种电泳方法。4.3.1纸电泳@[e-mail]@[e-mail]纸电泳（PE)是指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳，由于操作简单方便，因此在很多领域得以广泛应用。比如，分离、确定某些蛋白质，如糖蛋白、脂蛋白等，尤其是在分离氨基酸的混合物时，PE是一种很有价值的分析技术。在这种平卧式滤纸电泳装置(见图6-2)中，将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。图6-2平卧式电泳槽装置示意图4.3.2乙酸纤维素薄膜电泳乙酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素乙酸酯。由该物质制成的薄膜称为乙酸纤维素薄膜。电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。4.3.3凝胶电泳由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。因此，该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测。4.3.4等电聚焦电泳等电聚焦电泳是20世纪60年代中期问世的，一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。因为这种电泳方法具有很高的分辨率，所以在等电点上只要有0.01pH单位的差异就能被满意地分离。因此，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。等电聚焦电泳法的特点①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度;②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面;③电泳速度快;④分辨率高;⑤加入样品的位置可任意选择;⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点;⑦适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。4.3.5等速电泳等速电泳（CITP）是一种“移动界面”电泳技术。是电泳中惟一的分离组分与电解质一起向前移@[e-mail]@[e-mail]动，同时进行分离的电泳方法。同等电聚焦电泳一样，等速电泳在毛细管中的电渗流为零，它采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。图6-3是阴离子等速电泳示意图。CITP适用于小离子、小分子、肽类及蛋白质的分离。图6-3阴离子等速电泳示意图等速电泳特点：一是所有谱带以同一速度移动。二是区带锐化。三是区带浓缩。4.3.6双向凝胶电泳（二维电泳）双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术又称二维凝胶电泳技术，是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，第一向采用等电聚集电泳。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳。广泛应用于生物学研究的各个领域，其原理是将高分辨率的等电聚集电泳和SDS-PAGE电泳联合组成双向电泳。4.3.7免疫电泳免役电泳是电泳分析与沉淀反应的结合产物。该技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再与抗体起反应，从而使本法更为微量化、多样化。因此，其应用范围日益扩大。该方法可以用来研究：①抗原和抗体的相对应性；②测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；③根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其他特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；④鉴定抗原或抗体的纯度。4.44.44.44.4电泳仪的主要技术指标电泳仪的主要技术指标电泳仪的主要技术指标电泳仪的主要技术指标4.54.54.54.5毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式4.5.1与毛细管电泳相关的基本概念电场强度、电泳淌度、迁移时间、电泳速度、电渗流、焦耳热。4.5.2基本工作原理溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。@[e-mail]@[e-mail]4.5.3毛细管电泳的特点高灵敏度、高速度、高分辨率、样品少、易自动化、应用范围广。4.5.4毛细管电泳分离模式毛细管电泳有多种分离模式，如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、等电聚焦毛细管电泳、毛细管等速电泳和毛细管电色谱等。4.5.4.1毛细管区带电泳毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis，CZE)也称为毛细管自由溶液区带电泳，根据组分的迁移时间进行定性，根据电泳峰的峰面积或峰高进行定量分析。它适用于小离子、小分子、肽类、蛋白质的分离，在一定限度内适合于DNA的分离。应用CZE分离人血清中氨甲喋呤（MTX）及其代谢产物7–羟基氨甲喋呤（7–OH–MTX）。4.5.4.2毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。CGE正在向第二代DNA序列测定仪发展，并将在人类基因组计划中起重要作用。4.5.4.3毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱又称微团电动毛细管层析，该技术的最大特点是使毛细管电泳有可能在用于离子型化合物分离的同时进行中性物质的分离，加强了毛细管电泳的选择项，弥补了中性分子分离方向的不足。因此在各个领域特别是生物药物领域显示了广泛的应用前景。4.5.4.4毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳是在电场作用下，带电的分子会在电解质中作定向的迁移，毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。4.5.4.5毛细管等速电泳毛细管等速电泳是一种较早采用的模式，是电泳中唯一的分离组分与电解质一起向前移动的同时进行分离的电泳方法。常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质。4.5.4.6毛细管电色谱毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充或在毛细管壁上键合（或涂壁）固定相，从而构成毛细管色谱柱，依靠电渗流推动流动相，携带样品迁移，根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差别而分离。它与色谱法的不同在于，流动相通道色谱柱的推动力是电场力，而不是压力。它与区带毛细管电泳法的区别是具有电泳与色谱二种作用力，因此适用范围更广泛。