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MAGE一1、结核杆菌HSP70与MAGE．3融合基因的构建、原核表达及分离纯化1引物设计GenBank:构建重组质粒pET28a--MAGE-1--HSP70--MAGE-3转化感受态大肠杆菌DH5a.筛选阳性克隆,提取质粒及酶切鉴定,测序2MAGE-1．HSP70-MAGE．3融合蛋白的原核表达与分离纯化---将含有重组质粒的大肠杆菌DH5a接种于5mL含30pg／mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇菌过夜---取500pL过夜菌接种于125mLSOB中，加入Mgcl2，37℃，250rpm摇菌6小时；---加入2509LlM的1PTG至终浓度为lmM，诱导表达4小时。---取lmL茵液用于SDS-PAGE鉴定3融合蛋白的分离与纯化---将诱导表达的菌液，8000r离心5min。---取1000ml菌体沉淀用40mLLysisbuffer重悬，加溶茵酶，冰浴，超声裂解细菌，于4℃离心20min，取上清和沉淀，SDS-PAGE鉴定目的蛋白的可溶性---将细菌裂解液的沉淀重悬，离心5分钟，取上清和沉淀再做SDS-PAGE分析，进一步确定目的蛋白的可溶性。---将细菌沉淀变性，8M脲裂解，上6xHisNi-NTAResin柱，洗脱，得纯化的变性蛋白，装入透析袋中，用梯度脲各透析24h，使纯化的融合蛋白复性我们的包含体复性过程是这样的：包含体如1g－含8MUrea缓冲液buffer20ml，过夜搅拌溶解－离心取上清继续实验－6MUrea缓冲液buffer200ml透析2hr－4MUrea缓冲液buffer200ml透析2hr－2MUrea缓冲液buffer200ml透析2hr－0MUrea缓冲液buffer20ml透析过夜－离心取上清进行复性效率分析我们的复性效率约为20％左右，但我们没有要求过活性，一般包含体复性后很难保持生物活性的。仅供参考---SDS-PAGE鉴定表达蛋白，Brandford法测定蛋白含量。---凝胶薄层扫描测定蛋白浓度。---ATP亲和色谱法把30mg复性的融合蛋白ATP-agarose4B柱进行了活性鉴定和纯化，冻干，-70℃保存。