2016-4基因突变的应用

第4章基因突变的应用第一节诱变育种第二节突变株的筛选与应用第三节菌种退化及其防止第一节诱变育种目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。一、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。自然选育是一种简单易行的选育方法，它可以达到纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢。因此，经常把自然选育和诱变育种交替使用，这样可以收到良好的效果。一般程序：⑴自然选育（自然分离）是把菌种制备成单孢子悬浮液；⑵经过适当的稀释以后，在固体平板上进行分离；⑶挑取部分单菌落进行生产能力的测定；⑷经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。二、诱变育种1、诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。2、诱变育种在育种工作中的作用（1）提高目标产物的产量菌株NRRL-B25的诱变过程StrainMutagenYield(U/ml)TimeNRRL-B252501943NRRL-X1612X-rays5001943NRRL-Q176UVlight8501945NRRL-WIS-47-1564UVlight8501947------500001977（2）改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件（3）开发新产品庆大霉素生产菌棘状小单孢菌耐受无机磷突变株MechinosporaMutant129-P1产生一种新的氨基糖苷抗生素复合物GP，经分离纯化获两个单组分GPA和GPB。研究结果证明抗生素GPB与紫色小单孢菌突变株M.Purpureaji20所产生的抗生素JI-20同质，抗生素GPA与相模湾小单孢菌突变株M.sagamiensisNRRL110060/31生物转化的产物抗生素TBJ-B同质。（4）给代谢调控育种提供技术手段3、诱变育种工作中应注意的问题A选择好出发菌株选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及筛选条件。B复合诱变因素的使用在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学诱变因素来处理菌种。对野生型菌株单诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。C剂量选择各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如紫外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑）每千克，中子剂量单位是戈。化学诱变因素一般是以溶液浓度来计算剂量单位的。对不同微生物使用的剂量是不同的，致死率取决于诱变剂量，而致死率和变异率之间有一定关系。因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。D变异菌株的筛选诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的，一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性，并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型菌株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的关系。这样，可大大提高筛选的工作效率。E高产菌株的获得需要筛选条件的配合在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适的筛选条件的配合，如果忽视这一点，则变异后的高产菌株不可能被挑选出来。诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须用辩证的观点来看待。只重视诱变而忽视筛选，或过份重视菌种而忽视发酵条件的观点都是片面的，这样会影响高产菌株的获得。总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系。全面辩证地考虑上述三者之间的关系，将是诱变育种能否获得理想效果的重要关键。①对早期生物技术的发展贡献巨大；②适用于途径或基因未得到研究的菌株；③产生的变异程度相对较低；④变异的位点及性质不明；⑤实质上也是基因的变异，没有相应的基因就不可能发生新功能。4、诱变育种技术的特点5、物理、化学诱变剂的使用方法A紫外线紫外线是一种使用时间较久、值得推广的诱变剂，它的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，故应用最广泛，研究得也最多。虽然紫外线的波长范围很宽，但对诱变最有效的波长仅仅是260nm左右（253－265）nm一般诱变时用菌（孢子）悬浮液进行处理，紫外灯的功率为15W，距离固定在30cm左右。紫外线诱变的操作步骤使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中，开盖照射；时间不短于10~20s，也不长于10~20min。B化学诱变剂的使用：化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是终止反应的方法很多。出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离选择优良突变株使用化学诱变剂的十分简便的方法：①平板上涂布出发菌株②在其上分区并放置诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的小滤纸片③保温培养④诱变剂周围有一透明的制菌圈，在制菌圈的边缘存在有若干突变株的菌落⑤一一制成菌悬液⑥分别涂布在琼脂平板表面并保温培养⑦长成大量单菌落⑧选出所需突变菌株。例如：N一甲基一N′硝基一N一亚硝基弧（NTG）亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12％一80％的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。它在pH低于5－5.5的条件下，形成HNO2而引起菌种突变；在碱性条件下以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用；在pH6时，两者均不产生，此时的诱变效应可能是由于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解NTG，可以提高处理浓度。通常在浓度为300μg／mL，温度为28℃和时间为60分钟的条件下进行处理，容易得到高产菌株。第二节突变株的筛选与应用一、抗噬菌体菌株的选育1、噬菌体的分布凡是有寄主细胞的地方，一般容易找到它们的噬菌体。2、抗噬菌体菌株的选育在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。这种裂解细胞的噬菌体称为烈性噬菌体。在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。细菌的抗性是基因突变的结果，抗噬菌体突变可以发生在接触噬菌体以前，它和噬菌体的存在与否无关。3、抗噬菌体菌株选育的几种方法根据基因突变规律，可采用自然突变和诱发突变等方法获得。（1）自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性突变频率很低。（2）诱发突变A敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗性菌株的频率。B还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。4、抗噬菌体菌株的特性试验无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株，在用于生产之前，均需经过反复验证，才能使用。（l）抗噬菌体性状的稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。此外，还可以观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。（2）抗性菌株的产量试验在选育抗噬菌体菌株时，既要求具有抗性，同时亦要求生产能力不低于原敏感菌株。（3）其正抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有遗传的相对稳定性。抗性表现力多种多样，可因细胞壁结构的改变而阻止噬菌体吸附侵入，也可因生理代谢的改变，使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放。这些菌株都具有真正的抗性。溶原性菌株则因细胞中存在原噬菌体，对同一类型噬菌体具有免疫性。表面上看来，这种菌株具有抗性，但可采用物理、化学因素诱导不同的敏感菌看它是否会释放噬菌体。出现噬菌斑的菌株就是溶源菌，而不是真正抗性菌。5、噬菌体的防治不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现象是不同的，而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于侵染的时间不同，也会造成不同的后果。但都会出现畸形菌丝，菌体迅速消失，pH上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。噬菌体的防治是多方面的。大概可以分以下几个方面：（1）正确判断（2）普及有关噬菌体的知识（3）选育抗噬菌体菌株（4）消灭噬菌体在发生噬菌体感染时发酵罐排出的废气夹带有大量噬菌体，造成严重污染和扩散。因此，必须在排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。常用的药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室应尽量设法与外界减少接触，严格执行无菌操作，并检查空气中有无噬菌体存在。在噬菌体感染期间，车间内亦要定时检查噬菌体的分布情况，采取有效措施直至消灭为止。（5）收集和保存噬菌体在生产上出现噬菌体后要收集并保藏起来，以进行研究。因为这是选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。总之，防治噬菌体，应以预防为主，杜绝噬菌体的滋生，两者结合，才是有效的防治措施。二、营养缺陷型突变株的筛选与应用（一）营养缺陷型突变株的应用1、阻断代谢途径，积累中间代谢产物2、阻断分支代谢，改变代谢流向，积累另一终端代谢产物3、解除反馈抑制，积累代谢产物4、利用渗漏缺陷型进行代谢调控育种渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是一种遗传代谢障碍不完全。的营养缺陷型。其酶的活力下降但不完全丧失，使其能少量合成某一代谢产物，但产物的量又不造成反馈抑制。（二）营养缺陷型突变株的筛选步骤1、诱变处理2、后培养后培养是指诱变处理后，立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。3、淘汰野生型热差别杀菌法抗生素法菌丝过滤法饥饿处理法4、检出缺陷型和鉴别缺陷型5、生产能力测试三、代谢控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。反馈调节是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量合成时，抑制合成代谢途径的关键酶的活力或其酶合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。（一）直线式代谢途径中的反馈抑制（二）分支代谢途径中的反馈抑制①优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成，浓度过量后，抑制自身合成途径，使代谢转向合成另一个终产物。（例如黄色通杆菌优先合成谷氨酸，当谷氨酸过量后，使代谢转向合成天冬氨酸。）②协同反馈抑制：分支途径中两个或两个以上的终产物单独存在时不能抑制共同途径中第一个酶，只有几个终产物同时过量存在时，才能抑制此酶。③合作反馈抑制：分支途径中末端产物单独存在时仍有微弱的抑制作用，当几个末端产物共同存在时抑制作用增强。（AMP和GMP单独存在都对磷酸核糖焦磷酸酶有抑制，但共同存在时，其抑制作用大于两个单独存在时的和。）④累积反馈抑制：分支途径中每一末端产物单独存在时，只是部分地抑制共同途径中地第一个酶。各个终产物地抑制作用互不影响，只有同时过量存在时，才使酶活力完全受到抑制，并且抑制的总百分数等于各单独抑制