第一部分生物化学技术概论

第一部分生物化学技术概论本部分内容为生物化学实验中所涉及的主要技术原理、实验记录和实验报告的书写，介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验操作的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤、洗液的配制、吸量管的使用、样品的混匀以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液、样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分析和放射性同位素技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。§1实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践，掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力，也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，以及培养科学态度的重要环节。为此，要求学生在实验之前必须预习、理解基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地进行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录1.实验记录要整洁、字迹清楚。2.实验中观察到的现象、结果和数据，要及时地直接记在记录本上，原始记录必须准确简练、详尽、清楚。3.记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实验中观察到的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、分光光度计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录，并应根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应准确无遗漏地做好记录。4.实验中使用仪器的类型、试剂的规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。5.实验过程中，应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。6.完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果等。二、实验报告1.实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告。2.实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等项内容。3.书写实验报告时，目的和要求、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法、实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。4.一般实验，要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。§2普通实验技术一、玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器是生物化学实验中不可缺少的器具，玻璃仪器的清洁与否，直接影响实验效果的准确性。因此，玻璃仪器的清洁工作是很重要的。（一）新购玻璃仪器的清洗新购来的玻璃仪器，其表面附有游离碱质，可先用肥皂水洗刷，再用流水冲洗,浸泡于1~2％HCl中过夜，再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次，在干燥箱中烤干或晾干备用。（二）使用过的玻璃仪器清洗1.一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取洗衣粉或肥皂水，将器皿内、外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗2～3次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。2.容量仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，使用后应立即浸泡于清水中，勿使玷污物质干涸，并及时用流水冲洗干净，稍干后再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2～3次，晾干备用。3.比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净。如洗不净时，可用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷、粗糙的布或纸擦洗，以免损坏比色杯透光度，亦应避免用较强的碱液或强氧化剂清洗，洗净后，倒置晾干备用。二、清洗液的原理和配制（一）肥皂水、洗衣粉溶液和去污粉，是最常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。（二）铬酸洗液1.原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成，其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。铬酐越多，硫酸越浓，其清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。2.配制：称取重铬酸钾5g放于250ml烧杯中，加热水5ml搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸100ml，随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时溶液由红黄色变成黑褐色。冷却后，储于指定容器内盖紧以防吸水。3.使用：应用洗液前必须将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去，再放入洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分冲洗至无洗液为止（冲洗时注意勿将洗液溅出水槽），再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗涤液是最常用的，实验中遇到一些特殊污物，需用针对性强的洗涤液。（三）磷酸三钠洗液为5％Na3PO4·12H2O水溶液，此液为碱性，可洗涤油污物，但所洗的仪器不适于作磷的测定。（四）乙二胺四乙酸二钠洗液（EDTA洗液）为5%～10％的EDTA洗液，加热煮沸可洗脱玻璃内壁的钙镁盐类白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。（五）尿素洗液为45％尿素水溶液，用来洗血污，为蛋白质的最好溶剂。（六）草酸洗涤液可洗脱高锰酸钾的痕迹，用时加少量硫酸效果更好。（七）盐酸—酒精洗液3％盐酸酒精液，可除去玻璃器皿上的染料附着物。三、吸量管的种类和使用吸量管是生化实验中常用的仪器，测定的准确度与吸量管的正确使用密切相关。（一）分类生化实验常用的吸量管有三类（图1）：K2Cr2O7＋H2SO4H2Cr2O7＋K2SO42CrO3铬酐（红色）＋H2OCr2O3(绿色)＋3(O)H2SO4H2O＋SO2＋(O)1.奥氏吸量管：供准确量取0.5ml、1ml、2ml液体时使用。每根吸量管上只有一个刻度，放液时必须吹出最后残留在吸量管尖端的液体。2.移液管：供准确量取5ml、10ml、20ml等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体流毕后，将吸量管尖在容器内壁上继续停留15秒，注意不要吹出尖端内的最后部分。3.刻度吸量管：供量取10ml以下的任意体积的液体时用。每根吸量管上都有许多等分刻度，一般刻度包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。刻度吸量管的规格通常有0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ml等7种。（二）吸量管的使用1.选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清总容量和刻度。2.执管：用拇指和中指（辅以无名指），拿住吸量管上部，用食指堵住管上口和控制液流。刻度数字要朝向自己。3.取液：另一只手捏压橡皮球，将吸量管插入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端1~2cm处，然后迅速用食指按紧吸量管上口，以免液体1234图1三类吸量管简图1，2刻度吸量管3奥氏吸量管4移液管从吸量管下口流出。4.调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体时，先用滤纸擦干管尖外壁；然后用食指控制液体使之缓慢下降，当至所需刻度时，立即按紧吸量管上口（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上）。5.放液：放松食指，让液体自然流入容器内，放液时，管尖最好接触容器内壁，但不要插入容器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。6.洗涤：吸取血液、血清等粘稠液体及尿液标本的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净；吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，实验完毕后再冲洗。冲洗干净后，晾干，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后取出，再用流水冲净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。四、溶液的混匀样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染。严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。混匀的方式大致有以下几种，可随使用的器皿和液体容量而选用。（一）旋转混匀法用手持容器，使溶液作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。（二）指弹混匀法左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动。（三）倒转混匀法适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。（四）吸管混匀法用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。（五）玻棒搅动法适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀。（六）甩动混匀法右手持试管上部，轻轻甩动振摇，即可混匀。（七）电磁搅拌混匀法在电磁搅拌机上放置烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的，适用于酸碱自动滴定，pH梯度滴定等。（八）振荡器混匀法利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的。五、过滤是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。生化实验的过滤，操作与化学实验中的操作相同，应注意以下几点：（一）制备血滤液等实验过滤时，要用干滤纸而不能用水把滤纸弄湿，因为湿滤纸会影响血液稀释的体积。（二）折叠滤纸与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。一般采用平折法（即对折后再对折）。（三）向漏斗中加溶液时最好使用玻棒引流，倒入速度不要太快，不得使液面超过滤纸上缘。（四）组织匀浆等较粗样品的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时可用离心沉淀法代替过滤法。六、离心机的使用方法欲使沉淀与溶液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠、颗粒太小且能通过滤纸或总容量太少又需定量测定时，使用离心沉淀法优于过滤法。使用离心机前，应检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能；检查套管与离心管大小是否相配，套管是否铺好软垫（用棉药或橡皮），检查套管底部应无碎玻璃片或漏缝。检查合格后，将一对离心管放入一对套管中，然后连套管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的离心管必须放于对称位置。放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直到所需的转速。达规定时间后，将转速旋钮逐步调回零，待离心机停稳后，取出离心管。§3实验样品的制备在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。血样品常采用全血、血浆、血清或无蛋白血滤液。组织样品则常用动物的肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织。现将这些样品的制备方法扼要介绍如下：一、血液样品收集动物或人的血液时应使用清洁干燥的试管或器皿，以防止溶血。（一）全血取出血液后，迅速置于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混合，以免血液凝固。取得的全血如不能立即进行实验，应储存于冰箱中。常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠等，根据实验的要求而定，一般情况下使用肝素钠或肝素。抗凝剂的用量不宜过多，以免影响实验结果。通常每毫升血液加草酸盐1~2mg，柠檬酸钠5mg或氟化钠5~10mg，肝素仅需要0.01~0.2mg。可将抗凝剂配成适当浓度的水溶液，按需要量加到准备盛血的试管中，并涂布于试管壁，横放烘干（肝素不宜超过30℃）备用。（二）血浆将上述抗凝全血在离心机中离心，血细胞下沉，上清液即为血浆。分离血浆时，必须严格防止溶血，除采血时一切用具（注射器、针头、试管等）都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。（三）血清收集的血液若不加抗凝剂，在室温下约5~10分钟即自行凝固。血液凝固30~60分钟后，即可采用离心方式分离出血清。若血块粘附于容器壁过于牢固、血清不易分离出来时，可用细玻璃棒轻轻剥离血块。（四）无蛋白血滤液分析血液中某些成分时（如血液中的非蛋白氮、葡萄糖、肌酸等）为了避免蛋白质的干扰，需预先除