第七章 微生物的 生长 繁殖与及其控制

第七章微生物的生长繁殖及其控制第一节微生物生长繁殖及其测定一、微生物生长繁殖个体生长：原生质总量增加，个体增大繁殖：个体数目增加群体生长：个体生长＋个体繁殖＋代谢产物增多二、纯培养的分离方法纯培养：在实验条件下从一个细胞繁殖得到纯种群体分离原理：稀释样品，使各种细胞分开，再培养，使单个细胞生长繁殖成单菌落.挑取单菌落，再在平板上加以3－5次划线纯化。稀释混合倒平板法涂布法划线法单细胞挑取法：用显微挑取器选择培养基分离法其它分离方法:产孢菌分离：可先加热，杀死营养细胞，再分离病原微生物分离：选取敏感组织细胞数量少样品分离：先富集培养或浓缩样品三、微生物生长的测定（一）测生长量1直接法：称重量法：离心沉降物干重测体积法：离心沉降物体积2间接法比浊法：分光光度计，450～650nm波长生理指标法：含氮量；核酸；好氧量等（二）计繁殖数1直接法：计数板计数法（如血球计数板）2间接法：平板菌落计数法为活菌计数法把菌液稀释后，取一定量混合倒平板或涂布平板，培养后，每一个活细胞就形成一个菌落，此即菌落形成单位（colonyformingunit,cfu）。根据每皿上cfu数推算出样品含活菌数稀释倒平皿菌落计数法:第二节微生物的生长规律一、同步生长(synchronousgrowth)使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段叫同步生长。获得同步生长(synchronousgrowth)的方法：诱导法：如芽孢诱导萌发、藻类光照控制机械选择法过滤法离心法二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线（growthcurve）:定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的曲线单细胞微生物的典型生长曲线：把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，以细胞数目的对数对时间作图所得曲线。根据生长速率不同可分为延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期单细胞微生物典型生长曲线:（一）延滞期(lagphase)1延滞期特点净生长等于零或略有下降菌体粗大ＲＮＡ含量增加代谢活力强对不良条件抵抗能力降低2延滞期出现原因适应新环境；需要合成多种酶，尤其是胞外酶；DNA复制影响延滞期限长短因素接种龄接种量培养基成分4生产上：缩短延滞期可以缩短生产周期，提高设备利用率。接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄加大接种量。一般10％用与培养菌种接近的组分的培养基（二）指数期(对数期)(exponentialphase)1特点活菌数和总菌数接近酶系活跃，代谢旺盛生长速率最大，代时（generationtime）最短细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致生产上：多利用做该期的细菌种子和科学试验材料2出现原因细胞适应了新环境，开始大量分裂营养充足pH值EH值等理化条件适宜有害代谢产物少（三）稳定期(stationaryphase)1稳定期特点活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。细菌次级代谢物和代谢副产物大量积累芽孢杆菌这时开始形成芽孢稳定期中后期是生产收获时期：需要菌体在中期收获；需要发酵产物，尽量延长此期2出现原因营养的消耗营养物比例失调有害代谢产物积累pH值、EH值、温度等理化条件变化3生产上：延长稳定期补料：补充营养在线调节pH值、EH值等理化条件取走产物以上方法连续在线进行－－－连续培养（四）衰亡期(declinephase/deathphase)1特点细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型细胞死亡,出现自溶现象2生产上：避免衰亡期要连续监测发酵情况，最好在稳定期中后期停止发酵，避免进入衰亡期。一可缩短周期，二可避免细胞溶解物造成产物提取困难三、分批培养（batchculture)和连续培养(continuousculture)（一）分批培养：将微生物置于一定容积的培养基中培养，最后一次收获（二）连续培养：将微生物放在恒定容积的流动系统中培养，连续添加培养基，并以相同速度取走培养物优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一缺点：菌种易退化；易染杂菌第三节影响微生物生长的主要因素物理因素：温度、湿度、渗透压、射线、超声波化学因素：营养条件、O2、pH值、化学药物生物因素：在混杂群体中受其它微生物影响一、温度最适生长温度和最适发酵温度往往不一致低于最低生长温度时停止生长：低温菌种保藏高于最高耐受温度时死亡：酶失活，高温杀菌根据最适生长温度（optimumgrowthtemperature）分类实验室培养中温微生物常用温度：细菌：37℃放线菌、酵母菌：28℃霉菌：26℃低温对微生物的影响：酶活力下降，代谢下降，繁殖停止，进入休眠菌种低温保藏：冷藏：－4℃，冰箱冻藏：－20℃，冰箱超低温：－80℃，超低温冰箱－196℃，液氮，液氮罐二、pH值影响酶活性影响细胞膜透性与稳定性影响物质溶解度影响细胞表面电荷分布最适生长pH值与最适发酵pH值往往不一致微生物的活动也能改变环境中的pH值低酸保存食物：酸菜根据氢离子浓度对微生物分类嗜酸微生物嗜碱微生物耐酸及耐碱微生物三、溶解氧（O2）好氧菌（obligateorstrictaerobes）厌氧菌（anaerobes）兼性厌氧菌（facultativeanaerobes）微好氧菌（microaerophilicbacteria）耐氧菌（aerotolerantanaerobes）微生物与氧的关系第四节有害微生物的控制一、几个概念灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止/抑制微生物生长的方法化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖二、控制微生物的物理因素(一)高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65ºＣ10min可以致死。一般噬菌体65－80ºＣ致死，放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，76－80ºＣ10min可以杀死细菌芽孢，在121ºＣ下5－15min才能致死高温灭菌湿热灭菌(mosistheatsterilization)干热灭菌(dryheatsterilization)焚烧灭菌法：常用于废弃物动物尸体等处理烘烤灭菌法：实验室用干燥箱烘烤金属、玻璃器皿，170℃2h1湿热灭菌(mostheatsterilization)该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50％，蛋白质凝固温度为56ºＣ；含水6％蛋白质凝固温度为160-170ºＣ煮沸灭菌法（煮沸消毒法）高压蒸汽灭菌法间歇灭菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）煮沸灭菌法（煮沸消毒法）：物品在水中煮沸15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。高压蒸汽灭菌(normalautoclving)：是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2的压力下面（此时温度121ºＣ）处理15－30min。要排冷空气，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果（二）紫外线不能穿透2mm的玻璃，常用于空气和表面灭菌杀菌机制：诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制Ｏ２紫外线０３０２＋｛O｝（三）高渗作用高盐/高糖保藏食品等渗溶液对微生物生长有利细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离和蛋白质变性，导致死亡耐低不耐高（三）干燥干燥使蛋白质变性、酶活力下降、盐浓度上升，代谢下降甚至细胞死亡干燥保藏菌种、食品（四）超声波超声波破碎细胞，用于细胞内容物提取二、控制微生物的化学物质(因素)表面消毒剂溶液状态气体状态化学治疗剂抗代谢物抗生素生物药物素（一）表面消毒剂(surfacedisinfactant)酸和碱重金属极其盐类有机化合物氧化剂卤素染色剂表面活性剂1酸和碱微生物细胞中的DNA，RNA，E只有在中性条件下才能体现活性，因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。2重金属极其盐类是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的－SH结合。）0·02－0·2％HgCl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。0·1－1％AgNO3可消毒皮肤另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药3有机化合物醇、醛、酚是常用的杀菌剂杀菌机制损伤细胞壁使蛋白质变性（细胞膜，E失活）抑制脱氢酶，氧化酶活性甲醛：纯甲醛为气体，37－40％水液为福尔马林醇是脱水剂和蛋白质变性剂,70％乙醇杀菌效果最好酚：3－5％的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌，甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液4氧化剂K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。0·1－3％浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。5卤素氯，碘是常用的消毒剂碘杀菌力强，3－7％碘溶于70－83％的乙醇中成碘酒。氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（O）用于消毒。6染色剂如紫药水为结晶紫的乙醇溶液干扰菌体氧化还原电位阻碍芽孢的形成。7表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。常用的有新吉尔灭，去污剂，肥皂、洗涤剂等。表面张力降低可抑菌或杀菌（二）抗代谢物(antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。（三）抗生素(antibiotic)是由微生物产生（有的可人工合成）具有抑制或杀死其他微生物作用的有机化合物每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱神奇的抗生素抑制细胞壁的形成：青霉素干扰蛋白质合成：链霉素、金霉素、土霉素、四环素抑制核酸复制：增光霉素、丝裂霉素、放线菌素D影响细胞膜的功能:多粘菌素破坏G-细胞膜；制霉菌素破坏真菌细胞膜（四）生物药物素(biopharmaceutin)具有多种生理活性的比抗生素疗效更为广泛的微生物次生代谢产物酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂附：抗药性(antibioticresistance)菌体内产生了钝化或分解药物的酶改变细胞膜的透性而导致抗药性泵出机制细胞内被药物作用的部位发生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变。抗生素＋核糖体→结合→蛋白质不能合成应对抗药性：第一次用药剂量要足避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素不同抗生素（或其他药物）混合使用对现有抗生素改造筛选新抗生素思考题1名词解释：灭菌、消毒、分批培养、连续培养、效应巴斯德、代时、微生物生长、耐氧菌、巴氏消毒法、间歇灭菌法、抗生素、防腐、2试述主要灭菌方法及其原理、优缺点、应用范围3试述微生物液体培养过程中pH值变化原因及控制措施4兼性厌氧微生物为什么在有氧和厌氧条件下都能生长5试举例说明抗生素杀菌机理6试述稀释倒平皿菌落计数法的原理并图示操作步骤7什么叫生长曲线？图示并说明单细胞微生物典型生长曲线的特点、成因及其对发酵生产的指导作用8利用酒精酵母液体发酵生产乙醇，是否要求整个过程通气？是否采用相同pH值和温度？为什么？9从－196℃到170℃，与微生物学工作关系密切的温度（范围），有哪些？(提示：生长、抑制、杀灭、菌种保藏)