第七章 微生物的检验技术

微生物实验技术第七章微生物检验技术微生物检验技术实验7-1食品中细菌总数测定实验7-2食品中大肠菌群测定实验7-3食品中霉菌计数法实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验实验7-1食品中细菌总数测定一、实验目的了解食品中细菌的检测方法。二、实验原理菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。实验7-1食品中细菌总数测定三、实验材料1.器材恒温培养箱，冰箱，天平，电炉，恒温水浴锅，培养皿，lmL和l0mL吸管，500mL三角瓶，玻璃珠，培养皿，试管，酒精灯，试管架，灭菌刀或剪刀，灭菌镊子，酒精棉球。2.用品市售饮料，牛肉膏蛋白胨培养基，75％乙醇，生理盐水或其它稀释液定量分装于三角瓶和试管内灭菌。实验7-1食品中细菌总数测定四、实验方法菌落总数的检验程序见图7-1所示。(一)检样稀释及培养1.以无菌操作，将饮料检样25mL放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成1∶10的均匀稀释液（如为固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min的速度处理1分钟，作成1∶10的均匀稀释液）。2.用lmL灭菌吸管吸取1∶10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，作成1∶100的稀释液。实验7-1食品中细菌总数测定图7-1菌落总数检验程序实验7-1食品中细菌总数测定3.另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管，直至稀释到所需浓度。4.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度分别用吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌皿内，每个稀释度作两个平皿。5.稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置46℃水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌水(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。6.待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养24±2小时。实验7-1食品中细菌总数测定(二)菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。(三)菌落计数的报告1.平板菌落数的选择选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数。实验7-1食品中细菌总数测定2.稀释度的选择(1)应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例1)。(2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比如何来决定，若比值小于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字(见表7-1中例2及例3)。(3)若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例4)。(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例5)。实验7-1食品中细菌总数测定(5)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表7-1中例6)。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例7)。3.菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(见表7-1中“报告方式”栏)。五、实验报告用器皿图解的形式列出食品中菌落总数检验程序图。实验7-1食品中细菌总数测定表7-1稀释度选择及菌落式报告方式例次稀释液与菌落数两稀释液之比菌落总数(个/g个/mL)报告方式(个/g或个/mL)10-110-210-31多不可计16420—1640016000或1.6×1042多不可计295461.63775038000或3.8×1043多不可计271602.22710027000或2.7×1044多不可计多不可计313—31300310000或3.1×105527115—270270或2.7×1026000—1×10107多不可计30512—3050031000或3.1×104返回实验7-2饮料食品中大肠菌群测定一、实验目的了解食品中大肠菌群的检测方法二、实验原理大肠菌群系指一群在37℃、24小时能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群主要来自人或温血动物粪便，食品中检出大肠菌群则说明食品受到了人或动物粪便的污染，大肠菌群数量越多则表明粪便污染越严重，由此推测该食品存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁。实验7-2饮料食品中大肠菌群测定三、实验材料1.器材温箱，天平，显微镜，平皿，试管，吸管，载玻片，接种环。2.培养基和试剂乳糖胆盐发酵管，伊红美兰琼脂，乳糖发酵管，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%酒精，番红染液。四、实验方法大肠菌群检验程序见图7-2所示。实验7-2饮料食品中大肠菌群测定图7-2大肠菌群检验程序实验7-2饮料食品中大肠菌群测定1.检样稀释(1)以无菌操作将饮料检样25mL放于含有225mL无菌生理盐水或其它稀释液的三角瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成1∶10的均匀稀释液。(2)用lmL灭菌吸管吸取1∶10稀释液lmL注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1∶100的稀释液。(3)另取lmL灭菌吸管，按上项操作，依次作10倍递增稀释，每递增一次，换1支lmL灭菌吸管。(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度每个稀释度接种3管。实验7-2饮料食品中大肠菌群测定2.乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；lmL及lmL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告为大肠菌群阴性，如有产气者则按下列程序进行。3.分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。实验7-2饮料食品中大肠菌群测定4.证实试验在上述平板上挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。五、实验报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的最可能数。实验7-2饮料食品中大肠菌群测定表7-2大肠菌群MPN检索表接种水样总量11.11mL(10、1、0.1、0.01mL各1份)接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数1010.10.01－－－－90－－－＋90－－＋－90－＋－－95－－＋＋180－＋－＋190－＋＋－220＋－－－230－＋＋＋280＋－－＋920＋－＋－940＋－＋＋1800＋＋－－2300＋＋－＋9600＋＋＋－23800＋＋＋＋23800实验7-2饮料食品中大肠菌群测定其中:“＋”发酵阳性；“－”发酵阴性。①本表采用3个稀释度〔1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)〕，每稀释度3管。②表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字应相应降低10倍1如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。返回实验7-3食品中霉菌计数法一、实验目的1.了解霍华德(H。ward)霉菌计测装置。2.初步掌握番茄酱的霉菌计测方法。二、实验原理各种加工的水果和蔬菜制品在适宜条件下霉菌不仅能生长，还能繁殖。以番茄制品为例，在加工中若原料处理不当，产品中就会有霉菌残留。因此，利用霍华德霉菌计数法，可通过在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微视野，知道番茄酱中霉菌残留的多少，对番茄制品质量的评定，具有一定参考价值。实验7-3食品中霉菌计数法三、实验材料1.样品番茄酱。2.器材计测装置，显微镜，折光仪或糖度计，烧杯，量筒，托盘天平等；计测装置(包括载玻片、盖玻片、测微计)结构如图7-3至图7-5所示。四、实验方法检验程序:取样—→称样—→稀释—→调节视野—→涂片—→观察—→记录—→计算。实验7-3食品中霉菌计数法图7-3载玻片正视图实验7-3食品中霉菌计数法图7-4载玻片侧视图图7-5测微器（配片）实验7-3食品中霉菌计数法1.取样抽样数量按每班成品5t以下取样1罐，产量每增加5t，取样量增加1罐。2.检样制备番茄汁和调味番茄酱可直接取样；番茄酱或番茄糊需加水稀释为固形物含量相当于20℃下折光指数为1.3447～1.3460的标准样液。（1）称样用小烧杯在托盘天平上称取10g(约28.5％)番茄酱。（2）稀释向小烧杯中加入26mL蒸馏水，用玻棒搅拌均匀，即为折光指数1.3447～1.3460的标准样液。实验7-3食品中霉菌计数法3.标准视野的调节霍德华霉菌计测用的显微镜，要求物镜放大倍数为90～125倍，其视野直径的实际长度为1.382mm，则该视野为标准视野。检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片(测微器)的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，需经校正后再使用。如图7-6所示。实验7-3食品中霉菌计数法图7-6标准视野状态下两条标准平行线、配片大方格与视野外切的相互位置实验7-3食品中霉菌计数法4.涂片（1）检查玻片首先用擦镜纸或绸布沾酒精将载玻片和盖玻片擦净。（2）加样用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地涂布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片(盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入)。如果发现样液涂布不均匀，有气泡，或样液流人沟内、从盖玻片与突肩处流出等，应弃去不用，重新制作。涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为：2220.13.1416(1.382/2)0.10.15()rmm实验7-3食品中霉菌计数法5.观察记录（1）观察视野数及分布对一般样品，每个涂片均检查50个视野(每1个样品至少应测25个视野，才能代表样品的各个部分。如果检查结果阳性视野低于30％，则检查25个视野即可；如果在30％～40％之间，须检查50个视野；如果在40％～50％之间，须检查100个视野；如果在50％以上或超过更多，则要继续检查，直至检查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止)。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上(图7-7)，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。实验7-3食品中霉菌计数法图7-7计测室上50个视野的分布实验7-3食品中霉菌计数法（2）霉菌菌丝的鉴别霉菌菌丝往往与番茄组织难以区别，但能够很有把握地加以区别。在同一视野内霉菌菌丝的特征是：①霉菌菌丝一般粗细均匀。②霉菌菌丝体内含有颗粒，具有一定的透明度。③有的霉菌菌丝有横隔。④有的霉菌菌丝有分支。而番茄组织的细胞壁大多呈环状，粗细不均匀，细胞壁较厚，且透明度不一致。实验7-3食品中霉菌计数法（3）记录结果①阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径(1.382mm)的1/