第二章生物工业菌种

§工业生产常用的微生物及要求一、工业生产常用的微生物细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。啤酒酵母霉菌棒状杆菌短杆菌棒状杆菌yeasts霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素放线菌担子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类（alga）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。硅藻担子菌二、微生物工业对菌种的要求：原料廉价、生长迅速、目的产物产量高。易于控制、酶活性高、发酵周期较短。抗杂菌和噬菌体能力强菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素微生物菌种的衰退菌种的复壮菌种的保藏§工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退：微生物个体特征微生物群体特征各方面发生变化营养物质代谢和生长繁殖能力下降发酵周期延长抗不良环境的性能减弱目的产物的产量下降菌种衰退的原因菌种性能的改变防止菌种衰退的措施菌种衰退的原因菌种保藏不当提供不了当的条件或不利的条件经诱变得到的新菌株发生回复突变菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如低温、干燥、缺氧、黑暗营养饥饿等条件，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。尽可能保持其活力和使其不发生变异。高质量保藏，即要求保藏的菌种不死亡、活性不衰退、特性不变异、分类不紊乱；随时可提供保持有原始特性的菌种用于交换和使用。♪菌种连续传代是造成菌种衰退的直接原因。♪菌株经连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象逐渐显露。回复突变：指变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状退化的现象菌种遗传特性的改变菌种生理状态的改变菌种遗传特性的改变的原因异核现象导致微生物群体发生变异自发突变导致菌种遗传特性的改变突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种的不稳定性，易发生回复突变或产生分离子菌种生理状态的改变菌种是由一些变异株混合组成菌种培养基影响菌种的生理状态在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，影响发酵；菌种培养基营养贫乏，菌种在营养贫乏的培养基中多次传代会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰退甚至死亡因此培养基应选择具有传代后生产能力不发生明显下降、菌落不易衰老和自溶的正常形态菌落，孢子丰富的培养基。菌种的复壮提供良好的环境条件定期纯化菌种防止自身突变§生产菌种的改良杂交育种原生质体融合DNA重组技术指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具有新性状的菌株细胞壁细胞壁溶解酶细胞膜营养细胞原生质体原生质体融合融合细胞原生质体形成原生质体融合细胞壁再生原生质体融合的基本过程影响原生质体融合的主要因素菌体的前处理菌体的培养时间融合剂的浓度融合剂作用的时间阳离子浓度融合的温度及体系的pH值等影响原生质体再生的主要因素菌体自身的再生性能原生质体制备的条件再生培养基成分再生培养条件等DNA重组技术：就是把外源DNA分子结合到任何病毒、质粒、或其它载体系统中，组成新的遗传物质，并转入宿主细胞内进行繁殖的过程。可以从复杂的DNA分子中分离出单独的DNA片段。可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系统。DNA重组过程目标DNA片段的获得与载体DNA分子的连接重组DNA分子引入宿主细胞筛选含有所需重组DNA分子的宿主细胞对外源基因的表达及稳定性的鉴定基因的分离去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋白质，核糖核酸酶去除RNA，乙醇沉淀等步骤。特异目的基因的分离主要采用：物理分离法、互补DNA分离法和“鸟枪法”等。DNA分子的切割与连接用限制性核酸内切酶（Ⅱ类，识别顺序通常为4~6个核苷酸）进行切割；限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等，利用DNA连接酶来实现DNA分子的连接载体能在大肠杆菌中自主复制对某些限制酶来说只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。从细菌核酸中易于分离和纯化。在宿主中能以多拷贝形式存在，有利于插入的外源基因表达，能在宿主中稳定地遗传质粒：重组DNA以转化的方式进入宿主细胞λ噬菌体：重组DNA以转染的方式进入宿主细胞柯斯质粒：以转导的方式进入宿主细胞引入宿主细胞