第八章微生物遗传

第八章微生物遗传一．遗传的物质基础1．转化实验1928,GriffithRII+SIII(加热杀死)小鼠死血液中分离出SIII1944,Avery等证明只有SIII的DNA才能将RII转化为SIII,DNA是遗传物质.RIISIII的DNASIII型细菌SIII的DNA+除DNA酶以外的酶SIII的DNA+DNA酶SIII的RNARII型细菌RII型细菌SIII的蛋白质SIII的荚膜多糖2．噬菌体感染实验1952年Hershey证明T2噬菌体的DNA含有整套遗传信息3．烟草花叶病毒拆分实验烟草花叶病毒拆分实验1956年Fraenkel-Conrat烟草花叶病毒拆分实验证明RNA是遗传物质二．微生物的基因组基因组（genome）：一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称.细胞或病毒中的所有基因以及非基因的DNA序列的总称,包括结构基因,调控序列,功能目前尚不清楚的DNA序列.基因：编码多肽、rRNA和tRNA的多核苷酸序列。细菌、真核生物、古生菌基因组主要特点比较：染色体特点遗传信息连续性操纵子结构结构基因拷贝数/重复序列负责信息传递功能的基因（复制、转录、翻译）细菌Escherichiacoli的基因组染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的大量存在单拷贝重复序列少而短细菌类真核Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)的基因组典型的真核染色体结构有间隔区（即非编码区）和内含子序列，断裂基因没有明显的操纵子结构高度重复真核生物类古生菌Methanococcusjannaschii(詹氏甲烷球菌)的基因组染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；另外有有5个组蛋白基因，暗示同细菌同细菌同细菌类似于真核生物其染色体结构类似与真核生物三．质粒质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。1．质粒的分子结构：通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）2．质粒的检测：提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。3．质粒的主要类型质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应:致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子，抗药、抗重金属）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）----松弛型质粒(relaxedplasmid)低拷贝数(lowcopynumber)质粒（每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝）--—严谨型质粒(stringentplasmid)窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）4．质粒的不亲和性某些质粒可以在同一个细菌中并存，能并存的质粒属于不同的不亲和群（亲和现象），不能并存的质粒属于同一不亲和群（不亲和现象）。四、转座因子转座因子（transposableelement）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。遗传学效应①插入突变（无义，有义）；②导致染色体畸变（不同位置上的2个转座因子发生同源重组，导致的染色体DNA缺失、倒位）；③基因移动和重排。原核生物中的3类:IS（insertionsequence）;Tn转座子（transposon）;特殊病毒1．IS最简单的转座因子，250-1600bp，只含有转座所必须的转座酶基因，分布在细菌的染色体、质粒和某些噬菌体DNA上。引起无义突变，可以回复。IR（invertedterminalrepeat）2．Tn转座子授予宿主某些遗传特性的基因，如抗生素，抗毒物基因，乳糖发酵基因等。2种类型①复合转座子，2端为顺向或反向的IS，其他基因位于中部，Tn5②复杂转座子，2端为IR（30-50bp），其他基因位于中部，Tn3整合子(integrons)是存在于细菌中可移动的基因捕获和表达的遗传单位,通过转座子或质粒在细菌中传播遗传物质。大多数细菌的耐药性都是由于获得外源耐药基因而引起的.近年来,国外学者通过大量实验证明,整合子是细菌,尤其是革兰阴性杆菌多重耐药性迅速发展的主要原因。3．特殊病毒Mu-噬菌体E．coli的温和噬菌体，可以溶源化，也可裂解生长，含有噬菌体生长繁殖的必需基因，同时含有转座所必须的基因，因此是目前发现的最大转座因子。全长39kb，2端无反向重复序列。五．基因突变突变：可以通过复制遗传的DNA结构的任何改变.2类:基因突变:1个基因内部DNA结构的任何变化染色体畸变:大片段DNA的缺失、重复和倒位.DNA结构的任何改变可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。1．基因突变类型及其分离密码子:3个碱基对应1个氨基酸,是生物内负载遗传信息的基本单位.特点:①三联体密码子;②简并性4种碱基64个三联体密码(3个终止密码,UGA,UAG,UAA,61个密码子,20氨基酸);③非重叠性碱基改变与基因突变:同义突变,无义突变,移码突变,错义突变统一图表型变化及其分离表型:可以观察、检测到的个体性状或特征，是基因型在一定环境条件下的表现。基因型：DNA的碱基顺序几种常用的表型变化的突变型及其分离:营养缺陷型;抗药性突变型;条件致死突变型;其他突变型.①营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。表型判断的标准：在基础培养基上不能生长(负选择标记)影印平板（Replicaplating）法:Lederberg在1952年建立营养缺陷型的表示方法：在具体使用时多用hisC¯和hisC+，分别表示缺陷型和野生型②抗药性突变型（resistantmutant）基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示,strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性③条件致死突变型（conditionallethalmutant）在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。(负选择标记)影印平板法分离,和营养缺陷型不同的是培养基,完全培养基④其它突变类型:形态,菌落形态、颜色、噬菌斑形成，etc.非选择性突变,突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。2．基因突变的分子基础突变自发突变环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9。诱变某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。(1).自发突变特点:非对应性(自发性，随机性);稀有性;规律性;独立性;遗传和回复性;可诱变性突变率：每单位群体繁殖一代形成突变体的数目。如突变率为1×108，既意味着当108个细胞分裂一次平均形成一个突变体。三个经典实验:变量实验、涂布实验、影印实验证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！突变是自发产生的!分子基础:自发突变的原因:DNA聚合酶产生的错误;DNA的物理损伤;重组;转座;等主要原因:碱基的互变异构;移码突变;转座因子插入突变.移码突变的遗传学效应：①插入突变（无义，有义）；②导致染色体畸变；③基因移动和重排。RNA基因组的突变:高于DNA基因组1000倍以上。部分原因:RNA复制酶没有纠正活性；没有类似于DNA的修复机制。(2).诱发突变许多化学、物理和生物因子（称为诱变剂mutagen)能够提高突变频率，诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。诱变剂：•碱基类似物(Baseanalog)：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤•插入染料(intercalatingdye)：溴化乙锭和吖啶橙•直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂：亚硝酸:引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，造成碱基置换。羟胺:几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC→AT的转换.烷化剂:甲磺酸乙酯和亚硝基胍烷基化鸟嘌呤和腺嘌呤,烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。•辐射和热：紫外线：T-T二聚体，SOS修复χ-射线，γ-射线：DNA单链断裂；自由基。热：胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶•生物诱变因子：诱变剂与致癌物质——Ames试验诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his¯)的回复突变率。(3)回复突变(reversemutation或backmutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。六、DNA损伤及其修复主要的四种类型：光复活作用；切除修复；重组修复；SOS修复光修复（光能）：光复活作用暗修复（ATP）：切除修复，重组修复，SOS修复1.光复活作用：光解酶在黑暗中专一性识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合物，当有光照时，酶利用光能将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来2.切除修复暗修复的一种，是细胞内主要的修复系统。四种蛋白质联合作用：UvrA，UvrB，UvrC和UvrD3.重组修复：越过损伤而进行的修复。DNA的嘧啶二聚体仍然需经过其他的修复系统加以修复，或经过细胞的分裂而稀释。4.SOS修复DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。涉及一批修复基因及产物：recA（RecA，单链DNA的结合活性，以及由此而出的蛋白酶活性）lexA（LexA，调节蛋白，与操作子结合阻止基因的转录,可以被RecA–DNA切割成2个部分,此时无阻遏功能）uvrA（UvrA）uvrB（UvrB）uvrC（UvrC）RecA与DNA的结合能够抑制DNA聚合酶III的3’-5’外切酶活性,使DNA聚合酶顺利通过损伤部位,以错误为代价的快速修复过程,导致突变而保存生命.七、细菌基因转移和重组细菌的四种水平基因转移形式接合：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导：由噬菌体介导转化：游离DNA分子+感受态细胞原生质体融合：细胞原生质体融合1．细菌的接合作用(conjugation)机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导，F因子的分子量通常