细胞生物学实验指导目录

细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编前言本实验指导是在龚宁所编《细胞生物学实验指导》（2003年2月）的基础上修订而成，此次修订是根据实验内容的变化进行的，删除了已经纳入《生物技术大实验》的内容，增设了微分干涉差显微镜的使用、电子显微镜演示、细胞凋亡等内容。本实验指导编写过程中参考了杨汉民主编《细胞生物学实验》（1997年7月第二版）、李素文主编《细胞生物学实验指导》（2001年10月第一版）和中国农业大学生物学院所编《细胞生物学实验指导》（2000年4月），设置了15个实验，使用时可根据当时的具体情况选作10个。由于编者的水平有限，本指导中难免错漏之处，恳请使用本指导的师生提出批评和建议，以便及时修改。编者2007年1月3日细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编细胞生物学实验指导目录实验一细胞形态结构的观察及大小测定…………………………………1实验二微分干涉差显微镜的使用…………………………………………2实验三口腔上皮细胞的荧光观察…………………………………………4实验四叶绿体的提取………………………………………………………5实验五植物材料中DNA的提取……………………………………………6实验六细胞膜的渗透性……………………………………………………8实验七光镜下植物细胞骨架的制片技术及观察…………………………10实验八线粒体和液泡系的超活染色与观察……………………………11实验九DNA的细胞化学反应——Feulgen反应…………………………13实验十RNA的细胞化学反应——Unna反应……………………………15实验十一小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察……………………………17实验十二联会复合体的染色与观察…………………………………………18实验十三去壁低渗法制备植物染色体标本…………………………………19实验十四细胞凋亡……………………………………………………………22实验十五透射及扫描电镜演示实验…………………………………………23细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编实验一细胞形态结构的观察及大小测定一、实验目的：1、观察几种细胞的形态结构2、掌屋用测微尺测定细胞大小的原理和方法二、实验原理：测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两者配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃园片，园片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm(10μm)。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来标定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度=╳10μm目微尺格数例如：目微尺是100格，其对应的物微尺是80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100╳10=8μm。测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5格，则此细胞横径为8╳5=40μm。三、实验用品：普通光学显微镜载玻片盖玻片镊子消毒牙签烧杯吸管0.9%生理盐水蒸馏水吸水纸。四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞；洋葱内表皮；葫芦藓叶片；保存于阿氏液中的鸡血；甜椒五、方法步骤：（一）、细胞形态结构的观察：1、人口腔上皮细胞的观察：1）、在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。2）、用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。3）、把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下。4）、用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。5）、用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状。细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编2、取洋葱内表皮，同上法制作临时装片（将生理盐水换成蒸馏水），用显微镜观察，可见长条状的洋葱内表皮细胞3、取葫芦藓叶片，制作临时装片（制作方法同洋葱内表皮），用显微镜观察，可见内含许多叶绿体的叶细胞，细胞呈什么形状？4、制作鸡血涂片，用显微镜观察红细胞5、取甜椒一片，用刀片刮去果肉，将表皮制成临时装片，用显微镜观察表皮细胞，能看见胞间连丝吗？（二）、细胞大小的测定：1、将目微尺放于目镜内2、将物微尺放在显微镜的载物台上3、小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处4、记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度=╳10μm目微尺格数5、将制作的各种细胞临时装片置于载物台上，测定细胞的大小（包括长径和短径）。六、注意事项：1、制作临时装片时避免产生气泡2、用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况，这一数值会随物镜的放大率而改变，因此，在什么放大倍数物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测定细胞的大小。七、作业：1、绘出你所观察到的洋葱表皮细胞和葫芦藓叶细胞图，指出各部分的名称。2、列表说明你所测出的几种细胞的大小。实验二微分干涉差显微镜的使用——用微分干涉差显微镜观察口腔上皮细胞一、实验目的：1.了解微分干涉差显微镜观察活细胞的原理2.了解微分干涉差显微镜的特殊组件和位置3.掌握微分干涉差显微镜的基本操作步骤二、实验原理：微分干涉差显微镜是根据通过物体内只分开1um或者更短距离的2束相干的光之间的相位差设计的，使标本内邻近2点的光程差被显微镜中特殊的光学系统转变为振幅（光强度）细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编的变化。从而可以观察到标本内细微的结构，所以称为微分干涉差显微镜。根据照明方式，微分干涉差显微镜分为落射式和透视式2种，生物学和医学观察中多采用透射式微分干涉差显微镜。微分干涉差显微镜包含2块正交的偏光镜：一块靠近光源，称为起偏镜：另一块靠近目镜，称为检偏镜。在起偏镜和聚光镜之间放置第一块渥氏棱镜，在物镜和检偏镜之间放置第二块渥氏棱镜，这就是微分干涉差显微镜的基本结构。其基本原理是：来自光源的自然光经过起偏镜后成为线偏振光，以45度方位角（入射光偏振方向与晶体光轴之间的夹角）垂直入射到第一块渥氏棱镜，这时入射偏光分解为振动方向互相垂直、传播方向一致的O光和E光，穿过第一块渥氏棱镜的中心点后，由于晶体光轴方向的改变，O光和E光从中心点散发开一个很小的角度，经过聚光镜后产生出间隔只有1um甚至更短些的平行光，穿过样品的2个点。由于光线通过标本的2个点的光程长度不同，2束光线的相位都发生了变化，带有标本2个邻近点的相位差信息的这2束线偏振光通过物镜后，会聚在第2块渥氏棱镜的中心点，组合在一起的这2束线偏振光相位差不同，偏振方向互相垂直，不能直接干涉成像。当它们通过检偏镜后成为振动面相同、频率相同且具有一定相位差的相干光束，因而在中间像平面上形成干涉的物像。三、实验用品：微分干涉差显微镜载玻片盖玻片镊子消毒牙签烧杯吸管0.9%生理盐水吸水纸。四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：（一）、制作人的口腔上皮细胞的临时装片1.在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。2.用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。3.把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下。4.用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。（二）、用微分干涉差显微镜观察人的口腔上皮细胞1.将10×微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即N1。调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞的结构。2.将40×微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即N2。调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞结构。六、注意事项：1.选取的载玻片的厚度在1mm左右，不要太厚；要清洗干净。2.样品制备时，防止产生气泡。七、作业:1.根据所观察到的细胞，画一个口腔上皮细胞图，并且注出各部分的名称.细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编实验三、口腔上皮细胞的荧光观察一、实验目的：1、初步了解荧光显微镜的基本组件、位置和基本光路。2、初步掌握荧光显微镜的基本调节步骤。3、通过在荧光显微镜下观察口腔上皮细胞的细胞核和线粒体，了解荧光探针与细胞成分的结合特性和光谱特性。二、实验原理：本实验用的2种活细胞荧光探针分别为Hoechst33342（Ho.33342）和罗丹明123（Rho-damine123）。Hoechst33342（Ho.33342）是双苯并咪唑类的一种衍生物,是一种亲脂性物质,能跨膜进入活细胞,在低浓度下毒性较弱.是一种能与DNA特异性结合的荧光探针,该探针的特点是既能与死细胞又能与活细胞的DNA特异性结合,因此被大量地应用于活细胞观察与定量的科学研究工作中。它的激发光波长约350nm，发射光波长约461nm。罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光探针，也能穿过活细胞的膜。实验证实，罗丹明123被线粒体吸收与电性吸引有关。线粒体内膜本身因富含负电性的糖蛋白而带负电荷，内膜外有大量质子积累造成外正内负的跨膜电位差。而罗丹明123具有正电荷，由于电性相吸，特异地标记上线粒体。它的激发光波长约507nm，发射光波长约为529nm。可用蓝光激发，被标记的线粒体发出绿色荧光。三、实验用品：1、药品：含5-10ug/mlHo.33342的PBS(pH7·4)；含10ug/ml罗丹明123的PBS(pH7·4)2、仪器和用具:荧光显微镜、温箱、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、镊子、滴管等四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：1、用牙签刮取口腔上皮黏膜细胞，分别涂于2张载玻片上。2、在2张载玻片的涂细胞处分别滴加Ho33342染液和罗丹明染液各一滴，在37℃暗处孵育20-30min。3、加盖玻片（注意防止气泡），用滤纸条吸掉盖玻片周围多余的水分。4、荧光观察细胞核：先关闭激发光，将滴加Ho33342染液的装片至于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为紫外光（UV）、发射兰色荧光的滤片组合块下观察细胞核。先用10×荧光物镜观察，再换用40×荧光物镜观察。5、荧光观察线粒体：先关闭紫外激发光，将滴加罗丹明123的载玻片置于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为兰光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。先用10×荧光物镜观察，再换用40×荧光物镜观察。六、注意事项：细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编1.盖片时防止产生气泡2.滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察3.注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存4.荧光探针都有一定的毒性，操作时防止污染皮肤和环境七、作业：根据观察实验结果，填表细胞核线粒体荧光探针激发光发射光形态（画出）实验四、叶绿体的提取一、实验目的：通过本实验掌握分离叶绿体的技术，并了解制备细胞器的一般程序。二、实验原理：细胞器的分离一般采用差速离心法，细胞经过破碎后，在适当的介质中进行差速离心，利用细胞各组分质量大小不同，在不同离心力的作用下，即可得到所需的组分。三、实验用品：1、介质的配制：A：配制0.5M的蔗糖水溶液B：磷酸钾缓冲液:将KH2PO4(分析纯)溶于A液中,使其浓度为0.1M,PH调至7.4C：完全介质:将EDTA-Na2溶于B液中,使其浓度为10mM,PH调至7.42、低速大容量离心机细胞生物学实验指导龚宁宋庆发张玉霞编3、研钵一付4、尼龙织物或纱布5、台秤；塑料杯2个（平衡时用）6、玻璃漏斗7、烧杯(200ml)2个；滴管1支；50ml量筒1个8、显微镜；擦镜纸9、盖玻片和载玻片10、吸水纸四.实验材料:菠菜叶或玉米叶五.方法步骤:1、将材料洗净吸干后,称取鲜重10g,剪成1-2cm2小块.2、加入20ml完全介质,在研钵中充分研碎（介质可分步加入）3、用双层尼