细胞生物学技术

1第二章细胞生物学技术细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。细胞培养技术可将细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。近年来，分子生物学技术的广泛应用，更有力地推动了细胞生物学的发展。细胞生物学技术种类很多，包括物理技术、化学技术和实验生物学技术等，本章仅对主要的细胞生物学技术作简略的介绍，对于在细胞生物学研究中广泛应用的分子生物学技术，由于篇幅有限，本书不作介绍了。第一节显微镜技术显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（lightmicroscope）、电子显微镜(electronmicroscope)和扫描探针显微镜(scanningprobemicroscope)三个层次的显微镜和相应的技术。在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopicstructure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopicstructure）。随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。图2-1显示了不同分辨率时所看到的拇指表皮结构，从大体、显微、亚显微、一直到分子、原子水平。参照前书图参照前书图2-12图2-1细胞与原子比例图（引自Alberts等，2002）参照前书图2-1一、显微镜与分辨率人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。17世纪英国人Hooke和荷兰人Leeuwenhoek分别利用原始的光学显微镜发现了机体的细胞以及许多微生物，观察到了它们的微细结构，使生物学进入了光学显微镜时代，开创了组织细胞学的微观世界研究。但是不管多么完善的光学显微镜，它的分辨率极限为0.2µm，也就是说不能分辨出距离小于0.2µm的两个点。20世纪30年代，德国的Ruska发明了电子显微镜，突破了光镜的局限，其分辨率可达2nm左右，使人们对于细胞结构认识逐步深入到超微观世界。20世纪80年代IBM苏黎世实验室的Binning等人发明了扫描隧道显微镜，分辨率达0.2nm左右，可直接观察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等结构。分辨率（resolution）是指区分开两个质点间的最小距离。对于任何显微镜来说,分辨率都是最重要的性能参数。光学显微镜的分辨率与光波波长，物镜数值孔径有关，可用Abbe公式表示：0.61λd=n×sind为分辨率，ｎ为物镜与物体间介质折射率,空气为1，油为1.5，θ为光束进入物镜的半角，sinθ小于１(以极值1代入公式)。代入公式：d=0.61×0.5µm／1.5＝0.2µm因此在光学显微镜中，λ越短，分辨率越高；n和θ越大，分辨率也越高。n×sinθ简称N.A，即表示数值孔径，物镜上一般都标有N.A值，N.A值越大，分辨率越高。从上述计算中我们可以看出，光学显微镜分辨率受到光波波长的限制，大约等于所用光源的半波长。这是由于光波具有衍射现象，当光波波长大于物体二倍时，光波能绕过物体前进，就像没有遇到物体一样，所以在光镜下看不清直径小于波长一半的物体。当物体直径小于200nm（0.2µm）就分辨不清。3电子显微镜采用波长短的电子射线作为照明源，电子射线的波长约为可见光波长的十万分之一，约等于0.0053nm，但由于电子透镜相差的存在，限制了电镜的分辨率，使之不能达到如此高的程度。目前电镜的极限分辨率为0.2nm左右，比光学显微镜极限分辨率提高了约1000倍，比人眼分辨率提高了100万倍左右。扫描探针显微镜的制作原理与光镜和电镜完全不同，如扫描隧道显微镜是利用量子力学中的隧道效应原理制作成的，是目前分辨率最高的一类显微镜。其侧向分辨率达0.1～0.2nm；纵向分辨率达0.01nm。二、光学显微镜技术光学显微镜技术是研究细胞结构最重要的工具，在细胞生物学领域中应用最为广泛。近年来，随着多种现代生物学技术与光镜技术的结合，使光学显微镜展示出更新的活力。目前光学显微镜已发展成多种类型，用于各类不同的研究目的。在细胞生物学中常用的有普通光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、相差显微镜，以及暗视野显微镜和微分干涉差显微镜。（一）普通光学显微镜技术普通光学显微镜（简称光镜）是最常使用的显微镜，主要由三部分组成：聚光镜、物镜和目镜。光镜采用可见光作光源，分辨率为0.2µm，放大倍率为1000倍，其他几种显微镜都是在此基础上发展起来的。用于普通光学显微镜观察的生物样品必须应过一系列的组织处理并制成1～10µm的切片。常规的样品制备方法是：甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片，苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色，光镜观察。普通光学显微镜能观察染色的生物标本的结构，主要是因为光线通过染色标本时其颜色（光波的波长）和亮度（光波的振幅）发生变化，人的眼睛才能观察到。（二）荧光显微镜技术荧光显微镜（fluorescentmicroscope）是以各种特定波长光源激发生物标本中的荧光物质，产生各种可见颜色荧光的一种显微镜。荧光显微镜一般采用高压汞灯和弧光灯作为光源，在光源和反光镜之间放一组滤色片以产生特定波长的激发光，光谱一般从紫外到红外，从而激发各种荧光物质产生不同波长的发射光。利用荧光显微镜可研究荧光物质在组织和细胞内的分布，以达到对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察的目的。与生物学有关的荧光现象有三种：⑴自发荧光通过激发光会使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A等。4⑵诱发荧光通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光。⑶荧光染料染色荧光例如吖啶橙可以对细胞DNA、RNA同时染色，显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。荧光染料可和抗体共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光进行抗原定位。由于荧光显微镜技术染色简便、敏感度高而且图像色彩鲜明，所以是目前对特异蛋白质等生物大分子定性、定位的有力的工具。(三)相差显微镜技术相差显微镜（phasecontrastmicroscope）是一种可以观察活细胞或未经染色的标本的显微镜。相差显微镜能够改变直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。因此可以观察活细胞或未经染色的标本。相差显微镜与普通显微镜的主要区别是在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增加了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。观察活体细胞常采用倒置相差显微镜，它与一般相差显微镜的不同是光源和聚光器装在上方，相差物镜装在载物台下方，便于观察在培养瓶中贴壁培养的细胞，这样可清楚地分辨细胞的形态、细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。（四）微分干涉差显微镜技术微分干涉差显微镜(differentialinterferencecontrast)又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。微分干涉差显微镜利用的是偏振光，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且具有很强的立体感。微分干涉显微镜能使细胞核及较大的细胞器如线粒体等具有较强的立体感，比较适合于显微操作。目前多用于基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作。将微分干涉差显微镜接上录象机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。5（五）激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)，也被称为激光扫描细胞仪(laserscanningcytometer，LSC)。自20世纪70年代问世以来很快得到迅速发展，成为分子细胞生物学的新一代研究工具。激光扫描共焦显微镜在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统，整套仪器均由计算机自动控制，专用软件监控和执行各组件之间的切换。生物医学应用中LSCM的显微镜以倒置显微镜为主，便于活细胞检测。与普通光镜和荧光显微镜相比有一些明显的优点，其中主要有：（1）普通显微镜使用的光源为卤素灯，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量。LSCM的光源为激光，是单色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量。（2）普通荧光显微镜分辨率低，显示的图象结构为多层面的图象迭加，结构不够清晰。LSCM结构上采用双针孔(pinhole)装置，形成物象共扼的独特设计(如图2－2所示)。激光通过聚光镜焦平面上针孔形成点光源经物镜在焦平面上对样品进行逐点扫描，样品上每个照射点，反射后经过物镜折射到像焦平面的探测针孔处成像，经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品的不同焦平面发射来的干扰荧光。每个像点被光电倍增管(PMT)或冷电感藕合器件(cCCD)探测器接收。因为光学系统物象共扼，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图象，扫描后可得到信噪比极高的光学横断面，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM能以0.1um的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象地称为显微CT。（3）LSCM的高灵敏度、高分辨率和高放大倍数，减少了光淬灭的影响，提供了普通光学显微镜无法显示的结构信息，并适用于达到毫秒级的快速变化检测。图2-2激光扫描共焦显微镜物像共轭原理图参照前书图2-2LSCM最常用的功能是荧光检测、三维重建和显微操作等。其中荧光检测覆盖的内容极为广泛，通过多种荧光探针或荧光连接抗体，可对细胞内离子、pH值、各种蛋白6质分子进行动态测定。另外利用激光扫描还可以对细胞进行特殊操作，例如光刀切割法(cookie-cutter)作粘附细胞分选(adheredcellsorting)，能杀灭不需要的细胞，保留所选细胞亚群继续培养；激光光陷阱技术（又称为光镊技术）对目标细胞进行非接触式的捕获和固定，并进行精确操作；激光作为光子刀可以用来完成细胞膜瞬间打孔以及对线粒体、溶酶体、染色体和神经元突起的切割等显微细胞外科手术。三、电子显微镜技术电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术（techniquesofsamplepreparation）两大方面。电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同（图2—3），但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2Å，放大倍率达150万倍。样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。它包括普通样品制备技术（如超薄切片技术）和特殊样品制备技术（如电镜酶细胞化学技术）。第一台电镜