花色素苷生物合成相关基因的研究进展

花色素苷生物合成相关基因的研究进展张剑亮，王继华，吕冰，安康，曹干（广东省农业科学院作物研究所，广东广州510640）摘要：关键词：类黄酮化合物是植物次生代谢产物的一部分。类黄酮化合物可以以单体、二聚体和寡聚体的形式存在，几乎分布在植物所有的组织中，但主要在液泡中。它们也以有色寡聚/多聚分子混合物的形式存在于各种心材和树皮中。花色素苷是类黄酮类化合物中最重要的一类化合物。花色素常以苷类形式存在于植物细胞液泡中。花色素苷除了作为花、果实和种子的主要色素之外，还有其他多种功能。特异的类黄酮化合物还可以吸收紫外线，使植物免受紫外线B的辐射，从而防止紫外线对植物的伤害（EbelandHahlbrock,1982）；参与调节植物对生长素的反应（JacobsandRubery,1988;HarborneandWilliams,2000）；具有类似外激素的功能，吸引昆虫授粉。现今，人们之所以对花色素苷类化合物产生浓厚的兴趣，主要还是因为它给人类的身体健康带来很大的益处。饮食中的花色素苷类化合物可能对许多疾病具有预防和治疗作用。许多研究显示花色素苷类合物可以预防中风、抑制肿瘤发育，具有抗炎性，口服花色素苷对糖尿病和溃疡有好处。花色素苷类化合物作为一类类黄酮，同时也具备类黄酮的一般生理活性。大量研究已证实红葡萄酒的健康效果（特别是预防心血管疾病）与其所含有的花色苷及其聚合物密不可分。目前市场已出现以花色素苷为主要有效成分的改善视力的功能性或保健食品。不过，要注意的是不同种类的花色素苷的生理功能定位可能会有所不同。总之，花色素苷类化合物作为一类功能性基料，在功能性食品领域具有很好的应用前景（唐传核，2005）。1花色素苷的生物合成途径花色素苷的生物合成（图1.2）是由丙二酰CoA和香豆酰CoA在查尔酮合成酶（CHS；EC2.3.1.74）催化下产生查尔酮开始的。其中香豆酰CoA是从苯丙氨酸经过多步酶促反应形成的。苯丙氨酸脱氨酶（PAL；EC4.3.1.5）是这一系列酶反应中的第一个酶。该酶将苯丙氨酸转化为肉桂酸，将酪氨酸转化为ρ－香豆酸。该合成途径也是合成其他多种化合物（如类黄酮、木质素、芪类化合物和香豆素等）的起始点，因此受到发育和多种外界环境因素的调控。黄烷酮在黄烷酮-3-羟化酶（F3H；EC1.14.11.9）的催化下，C环第三位置羟化而形成二氢黄酮醇。该酶在一般条件下不稳定。由F3H催化所生成的二氢黄酮醇，通常是其他两种酶B－环羟化酶，即二氢黄酮醇3’羟化酶（F3’H）和二氢黄酮醇3’5’羟化酶（F3’5’H）的底物。由F3H、F3’H和F3’5’H三种羟化酶所催化反应的产物是合成花色素苷的直接前体。二氢黄酮醇被羟化的程度和位置不同，将决定最终合成的花色素苷的种类和花的颜色。如果B环的3’和5’位置都被羟化，二氢黄酮醇将变成二氢杨梅黄酮，这是蓝紫色的翠雀素糖苷的直接前体；如果B环只有3’位置被羟化，将变成二氢栎皮酮，这是红色的花青素糖苷的直接前体；如果3’和5’位置都没有被羟化，则转变成砖红色的花葵素糖苷。图1.2类黄酮的生物合成途径（赵昶灵等，2003）Fig1.2Biosyntheticpathwayofflavonoids从二氢黄酮醇转变成花色素苷的反应非常复杂，需要几个不同酶的作用。其中一些已被证实。由于这个过程的复杂性和中间产物的不稳定，精确的反应过程还没有完全搞清楚。二氢黄酮醇－4－还原酶（DFR）是将二氢黄酮醇转变成花色素苷的第一个酶。该反应需要NADPH，其产物是不稳定的无色花色素。花色素合成酶（ANS）是一个加双氧酶，催化从无色花色素到花色素的转变。这个过程还没有完全搞清楚，也许需要第二个酶，可能是个脱氢酶的作用（HellerandFerkmann.,1988）。不稳定的花色素形成后，类黄酮－葡糖基转移酶（UFGT；EC2.4.1.9）进一步催化，促使糖苷化转变成稳定的花色素苷。参与类黄酮化合物生物合成的酶类形成1个多酶复合体，这些复合体以一定的方式排列并催化生物合成途径中的顺序反应，对于细胞而言，活性位点的中间代谢物的直接转化有利于提高代谢的效率，原因在于代谢途径中许多分支点上存在对底物的竞争，而中间代谢物极其活跃并具有潜在的毒性，这些化合物的整体浓度很低，对于细胞而言，它需要对内外的信号作出快速反应并改变末端产物的种类和数量（Winkey-Shirley，2001）。Jaakola等（2002）图1.3类黄酮化合物生物合成途径中果实中参与花色素和黄酮醇合成的酶类及其大分子复合物模型A.产生杨梅素和槲皮素，进而生成翠雀素和矢车菊素来源的花花色素苷模型；B.产生槲皮素，进而产生矢车菊素来源的花色素苷模型；C.产生山奈素和槲皮素，进而生成天竺葵素和矢车菊素来源的花色素苷模型（Jaakolaetal.,2002）。Fig1.3Modelsfortheorganizationofflavonoidpathwayenzymesforproductionofanthocyanidinsandflavonolsinfruits,supposedlyasmacromolecularcomplexesattheendoplasmicreticulum.A,Modelfortheproductionofmyricetinandquercetininconnectiontodelphinidin-andcyanidin-derivedanthocyanins.B,Modelfortheproductionofquercetininconnectionwithcyanidin-derivedanthocyanins.C,Modelfortheproductionofkaempferolandquercetininconnectionwithcyanidin-andpelargonidin-derivedanthocyanins(strawberry,raspberry[partially]).比较完善地描述了这一多酶复合物体系的模型（图1.3）。2花色素苷生物合成相关基因花色素苷的生物合成是由许多酶催化完成的。花色素苷合成途径中几乎所有的基因包括一些调节基因（如玉米的R和C1）均已分离。这些基因可以分成两类，第一类是不同植物种类共同具有的结构基因，第二类是调控结构基因活性、色素空间和时间积累的调节基因。目前采用转座子标签、PCR扩增与异源杂交、差异cDNA克隆和遗传筛选相结合的方法及实验手段，分别在玉米、金鱼草和矮牵牛等材料中分离克隆到与花色素苷生物合成过程相关的关键酶基因。2.1结构基因结构基因是指不同植物共同具有的直接编码花色素代谢的生物合成酶的基因。利用转座子标签、PCR扩增、差异杂交、cDNA克隆等方法，已分别在玉米、矮牵牛、金鱼草等大部分植物中克隆出了多个与花色素苷生物合成相关的结构基因，如CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS以及3GT基因等（表1.3）。表1.3花色素苷生物合成相关结构基因Table1.3Structuralgenesofanthocyaninbiosynthesis基因Gene来源Taxon登录号AccessionNumber基因长度（bp）SequenceLengthPALArabidopsisthalianaAY0929572414ZeamaysNM_0011118642488IpomoeanilAF3254965172GerberahybridZ38099244VitisviniferaDQ887093668OryzasativaEF576230445CHSA.thalianaNM_1213961491Z.maysX602053829I.purpureaU159461835AntirrhinummajusX037103574Chrysanthemum×morifoliumDQ5212721416V.viniferaEF1924641182O.sativaX898591606CHIA.thalianaNM_126020696Z.maysZ227602278I.purpureaAF028238912A.majusM68326667ChrysanthemumEF094934720V.viniferaX75963979O.sativaNM_001072119890F3’HA.thalianaAK2271521362I.purpureaAB1132621877A.majusDQ2725921981ChrysanthemumEU286276580V.viniferaDQ7866321887O.sativaNM_0010708731863DFRA.thalianaNM_1236451358Z.maysX050684467I.purpureaAF0286011306A.majusX155361608ChrysanthemumEF0949351143V.viniferaY117491250O.sativaAB0034961480ANSA.thalianaAY0865391269Z.maysX553142837I.purpureaAF0286021376V.viniferaEF1924681144O.sativaY079551606UF3GTA.thalianaNM_1247851491Z.maysX135021594I.purpureaAF0282371494V.viniferaAB0470971925PAL是苯丙烷类化合物途径（也可能是所有次生代谢物代谢途径）中研究得最详尽的酶。在某些植物中，PAL似乎只由一个基因编码，而在另一些植物中，则是由1个多基因家族编码。菜豆的基因组里面包含了3个PAL基因（Crameretal.,1989）。Boss等（1996）认为在葡萄组织中虽然只有果皮合成花青苷，但PAL基因在大多数器官中均能表达。这说明PAL所催化的反应并不仅为花青苷合成提供前体，也为其他物质提供前体（李兴国等，2003）。在这个多基因家族中，不同成员的表达特异性不同。PAL多基因家族成员在表达上的差异是由于它们启动子所包含的cis-elements不同所引起的。正是由于这些cis-elements和相应的转录因子的共同作用，使得不同的PAL基因能在不同时间和不同组织里表达。例如，一个只在花里表达的Myb类转录因子与gPAL2启动子的P-box结合后能活化具有花组织特异性（Sablowski,1994）。CHS酶基因首先是从欧芹属Petroseliumhortense中分离出来的（Krenzaleretal.,1979;Harashimaetal.,2003;Huangetal.,2004）。很多物种的CHS基因有较高的核苷酸相似性，已构建的CHS基因系统树表明他们可能有共同的起源（Niesbach-Klõsgenetal.,1987;Yangetal.,2002；Huangetal.,2004）。功能上的相似性表明它们可能来自于脂肪酸合酶超基因家族（Koesetal.,1993）。CHS基因家族的进化历程也是一个基因重复的过程。牵牛的CHS基因在所有已克隆到的CHS基因中进化速率较快（Durbinetal.,1995;Yangetal.,2004）。最早进行花色改良的研究就是选择CHS基因作为调控对象。对CHS的反义调控使花色素合成被打断而使花色变淡，甚至变成白色或者粉色（白新祥和戴思兰，2005）。CHI基因已分别在豌豆、矮牵牛、苜蓿、翠菊、橙等多种植物中被克隆出来。在菜豆的基因组里，只有1个CHI基因（MehdyandLamb,1987），其表达能被真菌侵染和机械损伤诱导。在矮牵牛的基因组里由两个CHI基因（A和B）（vanTunenetal.,1988,1989）。CHI-A基因在花组织和经紫外照射的幼苗（或实生苗）里表达。而CHI-B基因仅在未成熟的花粉中表达。另外，CHI-A基因的表达与CHS-A和J基因的表达相协调，具有相似的器官和细胞表达特异性。F3’H已在多种