荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用

荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用高裕锋分析化学B200425012摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。一、FRET基本原理[3]FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。FRET指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。图1产生FRET条件示意图FRET的效率用E表示，E用式（1）计算：其中R0为Foster距离，表示某一给定给体与受60660RERR=+（1）240DDARconstnJκϕ-=⋅⋅⋅⋅（2）体间能量转移效率为50％时的距离；R为给体与受体的实际距离。R0可由式（2）计算：其中κ2是方向因素,n是溶剂的反射系数,ϕD是供体探针结合到蛋白的量子效率,JDA是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。由式（2）可看出R0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（1）中E值与R的关系紧密，这也成为了FRET用于测定分子间或基团间距离的重要理论依据。E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（E=1-IDA/ID，IDA表示A存在时D的荧光强度）；用量子产率表征（E=1-φDA/φD）；用荧光寿命表征（E=1-τDA/τD）。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET地发生。二、FRET探针FRET需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。荧光蛋白[6]是一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。荧光蛋白的突出优点是自身为生物分子，可有效地与目标分子融合，更易于在生物环境中使用，且其种类多，可满足不同光谱需要。其缺陷是分子体积大，空间分辨率较低，且可能与目标分子作用产生化学发光，需要较长地时间来确定荧光形式，不利于动力学研究。为克服这些缺陷，常使用荧光蛋白与其他染料联用或用其他染料对来研究。传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱地有机化合物组成地染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此应用较为广泛。镧系染料[7]一般与有机染料联用分别作为FRET的给－受体，其主要优点是：测量量可达10nm；与传统染料比准确性和信噪比大大提高；对不完全标记的给体或受体样品不敏感。近年来，随着荧光量子点技术的发展，荧光量子点也被用于FRET探针中。荧光量子点的吸收谱带较宽，而发射谱带较窄且对称性好，并可有效避免光褪色，作为荧光给体与其他染料配对，显示较高的灵敏度。三、在生物研究中的应用FRET的应用一般基于对其产生影响的三个因素：距离、光谱交叠情况和偶极。基于距离的方法一般是预先标记上给受体后，由于化学作用产生了距离的变化，达到检测目的。该方法原理较为简单，只要探针不对体系产生大的影响，可达到较好的效果，也是目前最常用的方法。基于光谱交叠的方法一般应用于发生化学反应后，分子自身结构发生变化，造成吸收光谱或荧光光谱的变化的体系，该方法对体系的选择要求较高，反应的机理不易把握。利用偶极取向变化达到检测目的的FRET技术对仪器和体系选择要求都较高，因此也较少使用。在生物研究中，常引入FRET探针来检测而不影响大分子的行为，因此检测机理多基于距离因素。1．核酸研究核酸是生命体的遗传物质，是生物物种延续和发展的基础，。FRET技术在研究核酸结构、DNA测序和核酸杂交等方面被广泛应用。对于核酸结构的分析[8,9]，主要是应用方程式（1），由E值测定R值，给出标记基团的空间距离。该方法可作为NMR的补充，使测定的核酸结构更为精密。该方法在检测核酸构像变化中也有较高的灵敏度。分子信标技术[10]是FRET原理的一个重要应用，是DNA测序和核酸杂交研究的经典方法。分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子（图2a）。它包括一个环（loop）－干（stem）结构，其中环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成，一般有15～20个碱基；干为两列互补的碱基序列，一般是5～7个碱基对；链端分别接上荧光发光基团（给体）和荧光猝灭基团（受体）。当发夹闭合时，FRET发生，荧光猝灭；而与具目标序列的分子结合时，干部分打开，荧光产生。Ozkan等[11]将荧光量子点作为荧光给体，设计新型的分子信标探针。荧光量子点的发射峰较尖锐且峰形对称，光褪色的作用也较小，与传统的有机染料对相比，当发夹闭合时，虽然FRET发生效率较低，但与靶分子结合后，由于量子点荧光较强，荧光增强的倍数高，检测灵敏度显著提高。TASC探针[12]（target-assistedself-cleavage）是另一类应用FRET原理的探针，其结构如图2b所示。与分子信标类似，TASC探针也由寡聚核酸形成的发夹型分子，不同点是在链中不同位置引入了一个DNA溶解酶和相应的DNA片断。当探针未与目标链配对时，给受体距离近，荧光猝灭；与目标链配对后，探针被拉开，荧光产生；引入酶活性物质，在一定温度下，酶可引发DNA片断溶解；溶解后的探针又脱离目标链。该探针的主要优点是可以在不破坏细胞膜的状态下，实现对细胞核酸的检测，而且检测后又可以通过溶解，脱离目标核酸。图2a分子信标的工作原理；bTASC探针的工作原理2．蛋白质研究蛋白质是生命体的功能物质，近年来对于蛋白质组学的研究已成为生命科学研究的重点。FRET技术与荧光成像技术联用，可用于蛋白质结构、蛋白质间相互作用及酶研究中。对蛋白质结构的检测[13]与对核酸的检测相似，用方程式（1），求算出标记基团间的空间距离。X-ray和NMR技术是结构鉴定重要手段，但是X-ray一般需要制备较好的单晶，而NMR在检测中需要较高的样品浓度，此条件下蛋白质容易聚合。FRET技术可以较准确测定1～10nm空间距离，这与蛋白质的尺寸较匹配，因此FRET常作为蛋白质结构测定的重要辅助手段。蛋白质间的相互作用的研究一般采用FRET与荧光成像技术联用[14]。将蛋白质标记上荧光探针，当蛋白质间不发生作用时，其相对距离较大，无FRET现象；而蛋白质发生作用时，FRET发生。用LSCM或WFM显微技术，从成像的照片中色彩的变化，可以很直观地反映该过程的发生，这有利于在空间上研究蛋白质的作用。用FLIM显微技术，研究荧光寿命，从给体或受体的时间分辨图，可研究FRET反应的动力学，这有利于在时间上研究蛋白质的作用。（图3）图3研究蛋白质相互作用的成像技术示意图酶的活性和酶的作用也可通过FRET直观观测。Schleifenbaum等[15]在pleckstrin（P47）蛋白中标记上荧光蛋白对，检测蛋白质激酶C的活性，在激酶作用下磷酸化时，pleckstrin的结构发生变化，FRET发生，由荧光光谱的变化，可反映该过程发生的程度。Stockholm等[16]应用多光子显微技术和FRET联用检测钙激活中性蛋白酶（Calpain）在活鼠臂肌细胞中的活性，通过三维成像，可有效、定量和实时地检测该酶在细胞中的活性变化。3．其他方面的研究FRET在生物领域研究的应用是广泛的，除了核酸和蛋白质的研究，在膜反应、离子通道等方面的研究也有相应应用。Li等[17]将FRET荧光探针标记的肽链，加入到固体表面的双层膜中，通过荧光漂白恢复（FRAP）成像技术检测，为研究跨膜螺旋二聚作用提供一个新的方法。Fisher等[18]用FRET标记细胞质，应用时间分辨技术，检测其对P2X离子通道的门控作用。四、总结与展望FRET因其对空间距离敏感性，可有效的作为1.0～10.0nm距离范围内的光学尺来研究生物大分子结构方面的问题，在分子与分子相互作用研究方面也备受关注。与时间分辨和显微技术结合后，在研究活体细胞中分子信息方面令人侧目，为其他传统方法不可企及。随着仪器设备的不断更新和方法的改进与完善，FRET在生命科学中的应用会更加广泛。参考文献：[1]Mochizuki,N.;Yamashita,S.;Kurokawa,K.;etal.Nature,2002,419,743.[2]Haj,F.G.;Verveer,P.J.;Squire,A.;etal.Science,2002,295,1708.[3]陈国珍,黄贤智,许金钩等.荧光分析法,科学出版社,1990.[4]Forster,T.Naturwissenschaften,1946,6,166.[5]Forster,T.AnnPhys(Leipzig),1948,2,55.[6]Kurokawa,K.;Takaya,A.;Terai,K.;etal.ActaHistochem.Cytochem.,2004,37,347.[7]Mathis,G.ClinChem,1995,41,1391.[8]Green,J.J.;Ying,L.M.;Klenerman,D.;etal.J.Am.Chem.Soc.,2003,125,3763.[9]Hong,M.K.;Harbron,E.J.;O'Connor,D.B.;etal.J.Mol.Biol.,2003,325,1.[10]江雅新,方晓红,万立骏,白春礼.分析化学,2004,32,668.[11]Kim,J.H.;Morikis,D.;Ozkan,M.SensorsandActuatorsB,2004,102,315.[12]Sando,S.;Narita,A.;Sasaki,T.;etal.Org.Biomol.Chem.,2005,3,1002.[13]Wang,D.;Geva,E.J.Phy.Chem.B,2005,109,1626.[14]Day,R.N.MolecularandCellularEndocrinology,2005,230,1.[15]Schleifenbaum,A.;Stier,G.;Gasch,A.;etal.J.Am.Chem.Soc.,2004,126,11786.[16]Stockholm,D.;Bartoli,M.;Sillon,G.;etal.J.Mol.Biol.,2005,346,215.[17]Li,E.;Hristova,K.Langmuir,2004,20,9053.[18]Fisher,J.A.;Girdler,G.;,Khakh,B.S.J.Neurosci.2004,24,10475.