蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础,蛋

蛋白质结构的保守性与可变性单分子与纳米生物医学实验室王冲学号：10203828蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。早在70年代，Anfinsen[1]就提出了蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说，认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的。天然蛋白质处于能量昀低（即热力学昀稳定）的状态。一般来说，天然蛋白质的结构是相对稳定的，结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的。蛋白质担负着复杂的生化反应，同时在生物合成以后，蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程。蛋白质自翻译以后，还需进行一系列的翻译后过程，包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等。这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换，不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制，而且还受动力学过程控制。这不仅是蛋白质拓扑学因素的需要，而且也是某些蛋白质生理功能调节所必需的。近年来，由于某些蛋白质结构转换和错误折叠所引起的“构象病”的发现，成了刺激蛋白质构象转换与生物功能关系研究热潮的一个重要原因。这里的结构转换（structuraltransformationorstructuralswitch）与通常意义的结构变化（structuralchange）或构象变化（conformationalchange）不同。前者指较大程度的结构变化，往往导致三级结构和二级结构的转变；后者则仅仅为蛋白质空间结构的扰动或柔性。但是蛋白质序列、结构与功能间的关系，至今仍不完全清楚，一方面，序列高度一致的蛋白质，其结构和功能高度相似；另一方面，一些序列一致性较低的蛋白质却也具有类似的结构和功能。因此，蛋白质序列、结构与功能的关系并不是一种线性的关系。目前，PDB中已有三维结构数据的蛋白质数目已超过7000，而至今尚未发现有两种不同蛋白质分子的序列是完全一致的。然而，通过对蛋白质结构的分类比较研究发现，所有已知三维结构的蛋白质，大致可分为全α、全β、α+β和α/β4个大类、327种折叠方式、463个超家族和652个家族[2]。毫无疑问，蛋白质的结构类型数远远低于它的种类数。一般来讲，同一家族中的蛋白质功能是相同的，甚至有些同一超家族中的蛋白质功能也是相同的。而目前已知三维结构的所有蛋白质仅652个家族，显然大大少于蛋白质的种类数。因此，在分子进化过程中，不仅蛋白质的三维结构较其序列更为保守[3]，实际上，蛋白质的功能也是高度保守的。然而，从某种意义上讲，结构与功能间的关系，似乎没有功能与序列中若干重要残基的关系那么严格。许多研究显示，仅仅1个残基的替换，就可能导致蛋白质功能的完全丧失或显著降低；而序列差异很大的不同蛋白质分子，则既可具有非常类似的结构和相同的功能，也可具有功能相差甚远的某种相似结构。一种类似的结构单元可以由不同的序列片段构成，例如，磷酸酶中由不同氨基酸顺序组成的βαβ结构单元，也存在于脱氢酶、黄氧还蛋白和激酶等蛋白质中。因此，蛋白质的三维结构也许主要是受物理、化学和几何因素的约束，而不是主要受其序列的约束。在进化过程中，维持蛋白质结构的残基不如保持蛋白质功能的残基保守[4]。目前，几乎所有关于序列与结构比较的研究都支持这样的观点：对于功能重要的残基是保守的，并且位于拓扑结构的等价位置[5，6]。然而，蛋白质三维拓扑结构的保守性，则似乎主要体现在保持某些共同的特有二级结构单元和折叠方式上。例如来自226种球蛋白序列和结构的比较表明，虽然它们的三维拓扑结构非常相似,但其中有的序列的一致性却只有16%，而且在所有的序列中仅有2个残基是保守的，但在进化中几乎所有的α-螺旋结构片段都得以保存下来[7]；在PTP中，也只有3个残基是保守的，但其核心结构中却保留了βαβ和βαβα2个保守的结构单元，尽管组成这2个结构单元的残基不尽相同。因此，人们认为，蛋白质的拓扑结构对于保持蛋白质的功能是重要的，不同的拓扑结构将导致不同的功能。虽然拓扑结构对于保持功能是必要的，但仅只是拓扑结构还不足以保证蛋白质功能的实现。在满足某种蛋白质特定功能所要求的拓扑结构的前提下，一些关键残基的存在，将是蛋白质功能得以实现的重要因素。因此，对于保持蛋白质功能非常重要的残基是高度保守的。但是，维持蛋白质结构的残基则是相对保守的，因为它们可以在蛋白质结构的任何位置上，从几个不同的“候选”残基中选择其中之一。蛋白质结构的转换，有同源肽段的结构转换、二级结构的转换、前体肽辅助蛋白质折叠、萤光素酶的亚基转换和蛋白质淀粉样化几种模式。下面重点就同源肽段的结构转换、二级结构的转换和蛋白质淀粉样化进行描述。1.同源肽段的结构转换许多实验表明，蛋白质多肽片段（fragment）在水溶液中具有与原同源肽段（segment）不一定相同的二级结构[8]；同一片段在不同的溶剂环境中能进行二级结构的构象转变[9]；甚至同一肽段在不同的蛋白质中的二级结构也不一样[10]。天花粉蛋白的α螺旋同源片段在水溶液中则形成β折叠结构，可在六氟异丙醇中则转变为典型的α螺旋结构[11，12]。Minor和Kim[13]曾设计一个称为“变色龙”肽段（chameleon），分别插入蛋白质G的IgG结合结构域的不同二级结构区域中，结果此肽段形成两种不同类型的二级结构。插入原α螺旋区域的肽段形成α螺旋结构，而插入原β折叠区域的同样肽段则形成β折叠结构。同样地，Gasset等[14]发现与传染粒子蛋白（prion）的α螺旋同源多肽片段形成β折叠结构的现象。另一有趣的研究进展是有关蛋白质炼丹术（proteinalchemy）问题，Dalal等[15]通过分子设计置换一半以下的氨基酸残基，可将一个β折叠为主的蛋白质成功地转换成为全α螺旋折叠类型的蛋白质。蛋白质中肽链序列虽然有一定的构象形成势，但不是绝对的。有时随着环境因素的变化而进行结构的转换。很可能这是蛋白质为了适应生物功能调节和进化的要求所必需的生理转化。2.二级结构的转换丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）家族是研究蛋白质结构转换的典型范例。体内新合成的或体外再折叠复性的纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogenactivatorinhibitor）具有蛋白酶抑制剂的活力（activeform，A型），A型抑制剂的活性部位是一段Loop区域，此结构可直接插入靶蛋白酶的活性中心形成复合物从而抑制蛋白酶的活性。有意思的是A型抑制剂能够慢慢转化成无活性的潜伏型（latentform，L型）抑制剂，其Loop区肽链转换为β折叠链加入抑制剂蛋白的β折叠片层中。因此，抑制剂活性部位有关的残基被包埋导致活力丧失[16]。另一些抑制剂，如α1-antitrypsin，其Loop区先被蛋白酶解再向β折叠链的构象转变成无活力的裂解型（cleavedform，C型）[17]。L型抑制剂可以通过变性和复性方法转变成A型，然后又慢慢变成L型。流感病毒血细胞凝集素（influenzahemagglutinin，HA）在pH诱导下的结构变化与细胞膜融合功能紧密相关的。HA在pH=7.0时，其空间结构是由helix-loop-helix的头状单体结构域组成的三聚体蛋白（HA-N）；可在低pH（pH5）条件下，中间Loop区域转化为螺旋结构并与另两段螺旋连接共同形成一股长螺旋，三条长螺旋再绕成三股螺旋束，称为成融态（fusogenicstate，HA-L）[18]。HA-L可介导病毒和宿主细胞的膜融合。另一例子是蛋白质生物合成过程中的延长因子EF-Tu，其中的开关区域（switchregion）的六个残基肽链Pro-Glu-Glu-Lys-Ala-Arg也存在α和β的构象转换[19]。当EF-Tu与GTP结合成为有活性的GTP型时，这六肽序列形成α螺旋结构；而它与GDP结合时形成无活性的GDP型，此序列则转换为β折叠结构。从上述例子可以看出，这种Loop/α、Loop/β或α/β间的二级结构转换构成蛋白质活性调节的开关。3.蛋白质淀粉样化已有很多事实证明，基因工程产物包涵体的形成和蛋白质淀粉样化（amyloidosis）所引起图1PrP的分子结构。左图为PrPc的结构，右图为PrPsc的结构的疾病都与蛋白质积聚有关[20]。蛋白质积聚往往由蛋白质的错误折叠所引起的，而蛋白质构般来说，蛋白质的一级结构决定高级结构，给定的一级序列就能自发地折叠成特定空间结构聚体中往往含考文献：thatgovernthefoldingoftheproteinchains.Science,1973,181(4096):223～ennerSE,ChothiaC,HubbardTJP.Populationstatisticsofproteinstructure:lessonsfrom.Biophys及性与蛋白质家族成员结构的保守性.动物学研究,1998,19(2):137～142.binamino型.生物化学与生物物理进展(ProgBiochemkmanLC.AshortlinearpeptidederivedfromtheN-terminalsequencehinbyNMR象元件的结构转换是导致蛋白质错误折叠的主要原因。典型的例子是与疯牛症病因直接相关的prion蛋白的积聚。正常细胞中PrPc的一段序列是α螺旋结构[21]，若此α螺旋发生结构转换成β折叠，则变成为积聚型的PrPsc（图1），PrPsc蛋白引起病状并有传染性[22]。如果在PrPsc蛋白中加入六氟异丙醇，则β折叠重新转化为α螺旋，同时积聚溶解并丧失传染性[23]。溶菌酶的氨基酸残基突变与人类某些淀粉样化疾病有关。Asp67His突变体的热稳定性下降且易形成纤维状积聚体，其中α螺旋结构明显减少，整个积聚体主要由β折叠结构所构成[24]。另外，βAPP蛋白（βamyloidprecursorprotein）的剪切和结构转换为β淀粉样肽（βamyloid），并以多肽链间的β折叠形成纤维状沉积物[25]。这种由于结构转换引起的淀粉样蛋白沉积与老年痴呆症的发生有关。其他容易形成淀粉样化并引起疾病的蛋白质还有transthyretin，crystallin等[20，26，27]。很显然，蛋白质的淀粉样化是许多“构象病”的直接原因。一和生物功能的蛋白质分子。这已有大量实验事实证明。然而，上述几个例子表明并不是所有蛋白质的天然活性状态一定是热力学上的昀稳定态；动力学因素对折叠途径和亚稳态的形成有一定程度的影响[28]。在某些特别蛋白质（如上所述）的折叠和功能过程中，动力学因素的作用相当重要。假如某个蛋白质折叠成天然态的活化能较大，折叠反应受动力学因素控制，先达到结构亚稳态；接着才受热力学因素的影响，蛋白质慢慢转化为能量昀低状态.从上述例子中看，具有β折叠结构的蛋白质容易形成积聚，而纤维状的蛋白质积有大量的β结构存在。蛋白质由于突变或其他因素引起α螺旋向β折叠的转换或许是比较普遍的结构转换模式，具有较广泛的生物学意义。这方面还有许多例子有待进一步发现。考察α螺旋和β折叠的结构特征，发现β折叠往往含较多的非极性残基，并埋在蛋白质内部形成疏水核心；而α螺旋通常是两性的，亲水面位于表面，疏水一侧朝向蛋白质内部。α/β的结构转换导致疏水核的暴露和亲水面的减少，容易引起蛋白质分子间形成交叉β折叠结构（cross-βstructure）这可能是引起prion等蛋白质分子间积聚的主要原因。那么，从热力学或动力学观点看，究竟是什么内在因素引起这种α螺旋向β折叠的转换。这或许是今后认识蛋白质结构转换和分子积聚本质的基础。参1AnfinsenCB.Principles2272Brstructuralclassifications.CurrentOpinionStruct.Biol1,1997，7:369-376.3BajajM,BlundellT.Evolutionandthetertiarystructureofproteins.Ann.RevBioeng1,1984,13:453-492.4黄京飞,刘次全.氨基酸残基可5OveringtonJP,JohnsonMS,SaliAetal.T