食品中微生物的检验

食品中微生物的检验一、概念和分类微生物并不是生物学分类学上的专门名词，而是对所有形体微小，单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚至没有细胞结构的低等生物的统称。微生物群体非常庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。细胞型微生物按细胞结构又分为原核微生物和真核微生物。原核生物的主要特点：细胞内有明显的核区，但没有核膜包围；核区内含有一条双链DNA构成的染色体；能量代谢和很多合成代谢均在质膜上进行，核糖体分布在细胞之中；相对于原核微生物，真核微生物的细胞结构有了真正的细胞核,有多种细胞器；而病毒则不具有细胞结构，由核酸和蛋白质组成，可以认为是超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。它们在活细胞外具有一般化学大分子的特征，在宿主细胞内又具有生命特征。可以作为了解的是，病毒可以通过细菌滤器，且对抗生素不敏感，对干扰素敏感。二、细菌、霉菌、酵母菌和致病菌介绍细菌的细胞结构在原核生物中具有代表性，主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成,有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。在自然界中细菌是分布最广、数量最多的一类生物，并与食品关系最为密切。是食品理论、工业发酵和酿造研究的主要对象，也是导致食品腐败的主要类群。细菌的基本形态有球状、杆状和螺旋状,分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌。霉菌是一些丝状真菌的统称。在自然界分布极广，它的营养来源主要是糖类和少量氮、矿物盐等，极易在含糖的食品、饼干、面包和各种谷物、水果上生长。经常会有食品会因为发生霉变而不能食用，还有些霉菌会产生毒性很大的毒素，比如黄曲霉素、黄米毒素、杂色曲霉素和展青霉素等等，都可能导致癌症，这类霉菌在大米和花生中最多。由此，对霉菌的检测尤为重要。霉菌菌体是由分支或不分支的菌丝组成，菌丝细胞均由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体以及内含物组成。在固体培养基上，部分菌丝深入培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空气生长，称为气生菌丝；有的气生菌丝发育到一定阶段分化为繁殖菌丝。霉菌的菌落一般比细菌菌落大几倍到几十倍，同一种霉菌，在不同成分的培养基上形成的菌落特征可能有变化，但各种霉菌，在一定的培养基上形成的菌落大小、形状、颜色等却相对稳定。菌落特征也是鉴定霉菌的重要依据之一。酵母菌多数为单细胞，一般呈圆形、椭圆形、圆柱形或柠檬形，也有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，形成假菌丝，称为假丝酵母。酵母菌在适宜的培养基上形成的菌落与细菌相似，但比细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润、粘稠、易被调起，有些种因培养时间太长使菌落表面皱缩。三、培养基（北京陆桥）1、微生物的营养微生物同其他生物一样，需要不断地从外部环境中获取营养，才能够维持生命。微生物细胞主要有水、有机物和无机盐等化学成份组成，不同的微生物种类其细胞的化学组成也不相同，而且含量也有差异。因此，维持微生物生长所需要的化学元素的种类与含量也不相同。一般来说细胞含有某种元素的量高则细胞对这种元素的需要量也就大，含量低则需要量也小。这也是为什么我们不同的微生物培养要选择不同的培养基。另外，同一种微生物在不同的培养基上的菌落形态也有差别，所以在选择培养基是要注意。微生物所需要的营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以分为碳源、氮源、无机盐和生长因子四种类型。能被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中碳（氮）素来源的营养物质称为碳（氮）原物质；无机盐为微生物机体提供金属元素；有些微生物在含有氮源、碳源、无机盐的培养基上人不能生长，而需要添加某些生长因子，满足生长的需要，比如维生素、氨基酸、嘌呤碱基等。我们经常用到营养物质：单糖、淀粉等（碳源）；尿素、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏等（氮源）；硫酸锌等（无机盐）。2、培养基配制培养基是人工配制的合适于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，是进行微生物培养的基础。配制培养基需要遵循一定的原则：第一，根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；自养型微生物合成能力强，可以利用简单的无机物质合成复杂的细胞物质，其培养基可以由简单的无机物质组成。而异样型微生物合成能力差，不能以无机物质作为唯一营养源，就要在培养基中添加一些有机物质（比如葡萄糖等）。另外细菌和酵母菌对培养基的要求也不同，细菌一般用牛肉膏蛋白胨培养基培养，而酵母菌则用麦芽汁培养基培养。第二，注意各种营养物质的浓度和配比；微生物生长所需要的营养物往往是在浓度合适的条件下才表现出良好的作用，浓度大时反而对微生物生长期抑制作用。微生物只有在适合生长的条件下，才表现出应有的形态特征，而不适合的条件下生长，会是微生物的形态特征发生改变。第三，将培养基的pH控制在一定的范围之内，满足不同类型微生物的生长繁殖或积累代谢产物。各种微生物生长的最适pH各不相同，一般来说，细菌生长的pH在中性和微碱性之间（pH在7-7.5），酵母菌和霉菌生长的pH值通常是偏酸的（pH在4.5-6）。另外由于微生物在生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，会改变培养基的pH值，如果不及时控制，往往会导致生长停止。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐。3、培养基的类型及应用培养基的种类很多，按培养基组成物质的化学成分分为合成培养基和天然培养基；根据物理状态不同分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基（常用凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，硅胶是由无几的硅酸钠和硅酸钾被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，不含有机物，因而适合于用来分离和培养自养型微生物）；根据培养基的特殊用途，可将培养基分成基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等。基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基；加富培养基：在普通培养基上加入其他营养物质，用以培养某种或某类营养要求苛刻的一样微生物；选择培养基：根据某种或某一类微生物的特殊营养需求或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。比如，我们在培养基中加入青霉素或者四环素等抗生素（生长抑制剂，抑制细菌和放线菌生长），可以分离酵母菌和霉菌；通过在培养基中加入结晶紫或提高培养基中氯化钠的浓度（7.5%），可以从混杂的微生物群体中分别分离出革兰氏阴性菌或葡萄球菌；加孔雀石绿可以分离出革兰氏阳性菌。鉴别培养基：在普通培养基内加入某种试剂或化学药品，使得某种微生物在这个培养基上生长后，可以产生某种代谢产物，这种代谢产物可以与培养基中的特定试剂或化学药品起反应，产生某种明显的特征性变化。根据这种特点来区分微生物。比如：大肠菌群测定中，液体培养基中加入溴甲酚紫和发酵管，来指示微生物生长过程中是否产酸产气；伊红美蓝培养基是一种鉴别培养基，常用于检查乳制品和饮用水中是否含有致病性的肠道细菌，伊红为酸性染料，美蓝则为碱性染料。当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，与伊红染色，再与美蓝结合生成紫黑色化合物。在此培养基上生长的大肠杆菌形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。不能发酵乳糖的细菌产碱性物较多，带负电荷，与美蓝结合，被染成蓝色菌落。还可以加入明胶，看液化明胶的情况。四、微生物检验食品中的微生物检验项目主要有四个：菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌。首先，我们看一下菌落总数的测定。我们先弄清楚几个概念什么是菌落、菌落总数和细菌总数？我们都知道单个细菌用肉眼是看不见的，但是，当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。而菌落总数就是指食品经过检样处理，在一定条件下进行培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等），所得1mL（g）检样中所含菌落的总数。更确切地说即在需氧情况下，36℃±1℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。可见把菌落总数就等同于细菌总数是不确切的。我们可以看看长在营养琼脂平板上最常见的菌落形态，当然并不是所有的菌落都会长的这么规则，而且也不是所有的菌落都会长的这么大，像葡萄酒、水这样的样品长出的菌落就会很小。这就需要我们借助放大镜来观察，防止漏数菌落数。弄清这几个概念后，我们就来看一下菌落总数测定的具体操作步骤：（1）以无菌操作，将检样25g(25ml)剪碎放于含有225ml，灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。（3）另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增加一次，即换用1支1ml灭菌吸管。（4）根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时（从检样稀释到倾注平板不超过20min）将凉至46℃左右营养琼脂培养基注入平皿内15ml，并转动平皿使混合均匀。同时，将营养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，。取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。在操作过程中要注意几个事项：1.操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行灭菌处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。3.倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响菌的生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。4.倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。5.为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。6．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。7.在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜过紧也不能过松。9.倒培养基前，瓶口要过火焰。10.做空白对照，顺便可以鉴定一下你的器皿、培养基以及水是否灭好菌了。11.平板一定要倒置放入培养箱里，因为培养箱内环境温热，培养基内水份充足，培养过程中会形成水份，蒸发，遇到平板的顶部会凝聚形成水珠，这时如果不倒置，会滴到培养基表面，使琼脂表面湿润，细菌就会长“糊”了，从而不利于形成菌落。培养完后还要进行菌落计数的报告，这点也很重要，前面的工作做的再好，不会计数或是记得不准确前面的一切都是徒劳。（1）平板菌落数的选择选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状