食品生物技术

第七章生物技术与食品安全和品质控制•第1节生物传感器及其在食品检测中的应用•第2节免疫学技术与食品安全检测•第3节分子生物学技术及其在食品安全检测中的应用•第4节生物芯片及其食品安全检测中的应用一、生物传感器的基本概念（一）生物传感器的定义传感器一种把一种信号转换成另一种信号以实现信号检测的元器件。•被转换的信号通常包括磁、力、热、光、电、化学，这些信号可以转换成声、光、电等信号以便分析和检测。第1节生物传感器及其在食品检测中的应用从传感器对不同能量进行变换的功能分类：•光（辐射）传感器•磁传感器•力（压力和加速度）传感器•温度传感器•化学传感器物理传感器生物传感器（biosensor）•以传感器为基础，由生物学、电化学、光学、热力学及计算机等学科相互渗透和融合的产物，是多学科的交叉领域。•属于化学传感器的范围•生物传感器的基本组成单位：•生物敏感元件/生物识别元件•(biologicalsensingelement)•是酶、抗原（体）和微生物细胞等具有分子识别能力的生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力•换能器/转换器（transducer）•能将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并且在一定条件下，产生的电信号强度和反应中物质的变化量呈现一定的比例关系•信号处理放大装置•（singalampligicationsystem）•能将换能器产生的电信号进行处理、放大和输出。（二）生物传感器的基本组成和分类1生物传感器的基本组成样品生物被测物生物识别元件换能器识别部位电信号信号处理装置2生物传感器的分类酶传感器微生物传感器免疫传感器细胞器传感器细胞传感器组织传感器DNA传感器生物敏感材料电化学生物传感器介体生物传感器测光型生物传感器测热型生物传感器半导体生物传感器压电晶体生物传感器换能器不同二生物传感器的基本原理（一）生物传感器的反应基础及分子识别机理•生物敏感材料中生物分子能选择性的和待测样品中的待测成分进行特异性结合的性质•包括酶、抗原、微生物细胞、组织切片、DNA等1酶促反应E+S→ES→P+E•E:酶•S:底物•ES:中间络合物•P:反应产物2免疫化学反应Ag+Ab=AgAb•Ag：抗原•Ab：抗体3微生物反应•利用微生物作为天然的生物催化剂进行的反应。•微生物细胞是一个极其复杂的、完整的生命系统，数以千计的酶在系统中高度协调地行使其功能•微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境，细胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性•在多底物反应时，微生物比单纯酶更适宜作催化剂•细胞本身能提供酶促反应所埯的各种辅酶和辅基•微生物细胞比酶的来源更方便，价格低4生物学反应中的物理量变化热焓变化生物发光颜色反应阻抗变化（四）生物传感器的特点•由于敏感物质经固定化，可重复使用•样品无需预处理，可直接分析•响应快，样品用量微•分析操作简单•除缓冲液无需添加试剂•不要求样品的清晰度•可连续分析，联机操作，易于实现自动化测量•传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器三、生物传感器在食品工业中的应用（一）农药和抗生素残留的分析•乙酰胆碱酯场效应管传感器，用于分析敌敌畏等有机磷农药的残留•乙酰胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，当存在有机磷农药残留时，能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使胆碱和乙酸的产生减少，乙酸的减少量可以通过离子场效应管来测定•抗生素残留的分析•免疫传感器测定牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量•抗体酶区轭物为敏感材料结合光度分析法检测了牛奶中青霉素的含量（二）食品添加剂的分析•亚硫酸氧化酶固定于玻璃电极上，结合流动注射分析系统制成了测定亚硫酸盐的生物传感器•天冬氨酸酶固定于氨电极上，制成生物传感器•烟碱酸（三）污染微生物的检测•利用微生物在代谢过程中产生电子，电子直接在阳极上放电产生电流，通过测定电流大小从而测定微生物浓度的传感器，检测酿酒酵母、乳酸菌•病原菌（四）生物毒素的检测•细菌毒素:由细胞分泌产生于细胞外或存在于细胞内的致病性物质•真菌毒素：真菌分泌产生的有毒次生代谢产物（五）食品新鲜度的分析•利用鱼死亡后，鱼肉中ATP分解代谢后各种代谢产物之间的比例关系做成生物传感器•肉鲜度传感器：单胺氧化酶固定于氧电极•牛乳鲜度传感器：牛乳中的微生物数量，乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量来评价一、常用的免疫学方法•所有的免疫学方法都是以抗原抗体特异性结合为基础发展起来的，这种特异结合可以发生在生物体内也可以发生在体外，用于食品卫生和安全检测的都是体外反应，必须使用含有特异性抗体的血清，又称为血清学反应或血清学方法第2节免疫学技术与食品安全检测（一）酶免疫分析（EIA）•抗原（抗体）被酶标记后与相应的抗体（抗原）反应，通过测定酶催化反应的产物量来计算抗原抗体的结合量，进而计算出待检测物质（抗原或抗体）量的方法。（二）酶联免疫吸附方法（ELISA）•酶标板为载体，在适当条件下使抗原或抗体上包被或吸附在酶标记板微孔的内壁上成为固相抗原或抗体，没有被吸附的被洗涤除去，然后加入酶标记抗体或抗原形成酶标记的抗得抗体复合物固定在微孔或试管上（三）免疫沉淀反应•将可溶抗原与相应抗体在适量的电解质存在的条件下发生特异性结合，形成抗原抗体复合物并出现肉眼可见的沉淀，这种沉淀只有在抗原抗体比例适合时才能形成。（四）免疫凝集反应•颗粒抗原（细菌、血红细胞）或可溶性抗原（抗体）结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体（抗原）在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝聚物的反应二、免疫技术在食品安全检测中的应用（一）在食品污染细菌及其毒素检测方面•沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、气单胞菌、霍乱弧菌（二）食品中污染真菌及其毒素的免疫分析•地菌属、根霉属、青霉属、曲霉属、毛霉属、分枝霉属、腐质霉属等（三）食品中农药残留的免疫学方法检测•农用抗生素残留、除草剂残留和有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类等（四）食品中抗生素残留的免疫检测•农用抗生素、畜用抗生素（五）食品中掺假物的免疫学识别•绵羊奶或山羊奶奶酪的生产中，掺杂有牛奶成分将影响绵羊（山羊）奶奶酪的品质和加工特性，因此在加工过程中应避免牛奶的掺入。（六）免疫学方法在分析样品净化中的应用•抗黄曲霉毒素、伏马素等的抗体包被在葡萄糖凝胶或琼脂凝胶颗粒上，形成免疫亲和层析柱第3节分子生物学技术及其在食品安全检测中的应用（一）分子杂交技术核酸的分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交膜杂交斑点印迹杂交Souther杂交Northern杂交•膜杂交：(二)PCR技术不对称PCR•两引物浓度不同，经过若于轮循环，低浓度的引物被用尽，产生大量由高浓度引物引导产生的单链DNA，可以作为探针或DNA测序的核酸多重PCR•同一反应中采用多对引物对基因的不同片段同时扩增，可以同时扩增多个DNA片段巢式PCR•采用两对引物，一对在DNA外侧，为外引物，另一对在内侧，称为内引物，实现对模板DNA含量很少的样品的分析和检测外引物外引物内引物内引物锚定PCR•只知道DNA片段一端的序列，在基因未知端添加已知的PolyA尾，人为的赋予基因未知末端特定的序列（三）在食品安全检测中的应用1样品前处理靶微生物的富集：•培养增殖法采用特定的选择性培养基通过培养增殖的方式来提高样品中的靶微生物数量，还可以降低样品中PCR抑制剂的浓度以利于靶DNA的PCR扩增PCR抑制剂的去除：•靶微生物的富集培养、凝胶过滤•土壤样品中微量的腐殖酸对PCR的抑制采用凝胶过滤2食品中污染微生物的分子生物学技术检测•细菌：亲水气单胞菌、肉毒梭菌=肠道致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌•病毒：轮状病毒、肝炎病毒、肠病毒•寄生虫、隐孢球虫、内阿米巴虫、梨形鞭毛虫第四节生物芯片及其在食品安全检测中的应用（一）生物芯片•按预先的设置排列固定有大量生物识别分子（例如DNA片段、RNA片段、抗原抗体分子或蛋白质、肽分子）的面积很小的载体（硅片、载玻片等）•将待测样品加在芯片表面，由于生物分子牧民性亲和反应，检测样品中的待检测成分分别和芯片上固定化的生物识别分子结合反应，从而实现对样品的分析和检测•分类：•DNA芯片、蛋白质（肽）芯片DNA芯片的制备方法：1、芯片制备•目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。2、样品制备•生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反应•杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。4、信号检测和结果分析•杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（二）、生物芯片的应用1、DNA芯片应用DNA序列测定•将未知序列的单链DNA片段和DNA芯片进行杂交，互补序列形成双链，通过分析鉴定双链体的情况可以得出未知DNA的序列DNA多态性的分析•检测生物群体中，个体间基因核酸序列的差异。•采用等位基因特异性的DNA探针固定在玻璃片上形成DNA芯片，采用PCR技术扩增待检测的基因组的DNA，得到荧光樗的单链DNA片段，将其与DNA芯片杂交，最后得到多态性的分析DNA突变检测表达分析2、蛋白质芯片的应用•2000年9月，《science》，蛋白质芯片研究蛋白质之间以及蛋白质与小分子之间的相互作用。•用于制备无烟煤各种蛋白质溶液中加入甘油，以防止蛋白变性，将蛋白质直接点接于载体膜上并固定化，之后以牛血清白蛋白进行封闭，降低膜上的背景，即得到蛋白质芯片。•2001年，《science》，将酿酒酵母5800个基因克隆并表达产生对应的蛋白质，分离纯化这些蛋白质，将它们固定于载体膜上得到蛋白质芯片•应用时将其他蛋白质或小分子物质与芯片进行反应，可以分析蛋白质之间或蛋白质与小分子之间的相互作用。3、生物芯片在食品安全检测中应用的前景食品中毒事件的调查食品污染生物毒素的检测食品中污染病原菌的检测食品中残留农药和抗生素的分析第八章转基因食品的发展和食品安全一、转基因食品的概念•使一种生物体具有其他生物体自然生长所没有的特点，由这种技术产生的食品可以分为原料类和加工成品类，我国习惯上将他们统称为转基因食品二、人们对转基因食品的争论（一）对人类健康产生影响•食品携带的抗生素有可能使动物与人的肠道病原微生物产生耐药性•抗昆虫农作物的安全性•引入病毒外壳蛋白基因的抗病毒农作物可能对人体健康产生危害（二）对环境和生态的影响•转基因作物本身可能变为杂草甚至导致超级杂草的产生•转入毒蛋白基因的作物的花粉可能有安全问题•有可能污染人类的食品供应•有可能产生超级病毒或新病害•未来破坏环境的可能•会威胁生物多样性•利益驱动可能导致农业崩溃（三）对贸易和政治的影响•转基因作物的贸易纷争实际是欧美贸易和政治关系的又一次对抗。•欧美的经济和政治利益矛盾冲突已久，对转基因作物的争论已远不是技术本身的一些争论三、转基因食品的安全性要求•对提供目的基因的供体和接受基因改造的受体，必须明确期在生物学上的分类和基因型及表型•进行基因改造用的基因材料的片段大小和序列必须清楚，不能编码任何有害物质•引入外源基因的重组DNA要稳定，基因改造后的生物体不应含有任何有害物质•含致敏源的基因改造食品，必须加以标明后方可进入市场四、转基因食品安全性评价（一）毒性•毒物动力学、遗传毒性、基因遗传与稳定性、微生物定植、微生物致病性、啮齿类90d喂养、验证对人类的安全性（二）过敏•过敏食物：蛋、鱼、贝