2013春西南大学基因工程作业全

1：[论述题]论述题1、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性核酸内切酶识DNA序列的结构特点。答：限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。限制酶的识别和切割位点通常是4～8个bp长度且具有回文序列的DNA片段，主要产生5′突出、3′突出的黏性末端或平端。当一个样本DNA被一个特定的限制酶切割后，可以产生一批相同碱基序列的DNA片段，进而可以用于基因重组、克隆、核酸分子杂交与序列分析2、什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同？答：Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。3、什么是基因组文库(genomiclibrary)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(genepool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。4、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？答：琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。5、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。简答题1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？答：（1）限制性核酸内切酶：识别并特异切割DNA碱基序列；（2）DNApolⅠ：催化缺口平移，制备高比度DNA探针；（3）Klenow片段：合成cDNA第二条链，补齐或标记双链DNA3′端；（4）TaqDNA聚合酶：DNA体外扩增(PCR)；（5）逆转录酶：催化合成cDNA；(6)T4DNA聚合酶：聚合补平或标记DNA平末端或3′凹端等；（7）DNA连接酶：催化2条DNA链之间形成磷酸二酯键；（8）大肠杆菌DNA连接酶：应用于黏端DNA或切口间连接；（9）T4DNA连接酶：应用于黏性或平末端DNA的连接；（10）末端脱氧核苷酸转移酶：给载体或cDNA加上互补的同聚尾、加标记物；（11）碱性磷酸酶：防止载体自身连接、32P标记5′端；（12）T4多核苷酸激酶：5′端磷酸化、5′端标记放射性核素。2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤：答：（1）分离制备目的基因――分”；（2）切割目的基因和载体――切”；（3）目的基因与载体的连接――接”；（4）将重组DNA导入宿主细胞――转”；（5）筛选并鉴定含重组DNA分子的受体细胞克隆――筛”；（6）克隆基因在受体细胞内进行复制或表达――表”。3、常用的目的基因的获取方法有哪些？答：（1）制备基因组文库；（2）构建cDNA文库；（3）PCR扩增目的基因；（4）人工合成DNA技术。4、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？答：⑴黏性末端连接：将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割，使它们两端产生相同的黏性末端。然后经黏性末端碱基配对，再经DNA连接酶作用，共价连接成新的重组DNA分子；⑵平头末端连接：将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下，使DNA分子的3′OH和5′P进行共价结合；⑶人工接头法：是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端，然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带相同黏性末端的载体相连；⑷同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶催化下，在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾；而在目的DNA分子的两端加上dC尾，两者混合退火，然后经DNA聚合酶Ⅰ或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸，再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。5、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。答：质粒是独立于细菌染色体之外，能自主复制的共价闭合环状双链DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，而且质粒含有复制起始原点(ori)，此起始点与顺式作用调控元件构成一个复制子(复制区内)，能借助宿主细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系独立地进行自我复制、克隆。6、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。7、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。答：(1)独立复制；(2)有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。8、PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？答：(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。9、cDNA克隆与基因组克隆有何不同？答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。10、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。11、试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？答：外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。12、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？答：将外源DNA或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。13、什么叫基因工程（GeneEngineering），试从理论和技术两个方面谈谈GeneEngineering诞生的基础？答：基因工程（GeneEngineering）又称基因操作（GeneManipulation）、重组DNA。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。理论上的三大发现和技术上的三大发明均在20世纪70年代完成，因而基因工程技术可以说是20世纪70年代诞生的。14、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr,neor）以及琥珀突变抑制基因supF。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。Ampr编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。Tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。15、YAC载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。大片断的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时减少完整基因组文库所需的克隆数目。名词解释参考答案：1、DNA重组：是指用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程。2、克隆：原指一个亲本细胞经无性繁殖产生无数个相同细胞的子代群体的过程。3、DNA克隆：是指将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的相同的DNA分子，又称分子克隆或基因克隆。4、目的基因：要分离和克隆的相应基因常称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内进行复制或表达，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因或外源性DNA。5、基因载体：能够携带外源DNA进入受体细胞内进行复制或表达的DNA分子，被称为基因载体。6、质粒：是独立于细菌染色体之外，能自主复制的共价闭合环状双链DNA。7、基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。8、载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。9、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。10、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。11、转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。12、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。13、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。14、DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。15、退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。16、DNA芯片：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。17、错义突变：DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。18、基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。19、限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。20、基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。21、cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA文库。22、RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数