2014-双向电泳(王)

双向电泳(dimensionelectrophoresis)[实验目的]学习和掌握双向电泳的基本原理和实验技术，为蛋白质组学的研究奠定基础。蛋白质组是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质。蛋白质组研究是近来兴起的生命科学的前沿领域，是生命科学进入后基因组时代的标志之一。DNAmRNAprotein蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。功能蛋白的立体构型。蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。它要求很高的灵敏度、精确度和分辨率，蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。蛋白质组实验室流程双向电泳2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术。第一向—等点聚焦(IEF)–pH梯度载体–pI第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)–SDS作为变性剂和助溶剂–分子量样品等点聚焦(第一向)双向电泳的基本原理与流程示意分子量pH梯度(pI)SDS-PAGE两性电解质pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向双向电泳又常被称为二维电泳，是1975年O’Farrall等人根据不同组份之间的等点电差异和分子量差异建立的一种蛋白质分离方法。第一向是以蛋白质分子电荷差异为分离机理的等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）电泳（isoeletricFocusing,IEF）。第二向是以蛋白质分子量差异为分离机理的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。[实验原理]+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH102-DElectrophoresisThe1stD:IsoelectricFocusing1.样品处理：包括蛋白质的溶解、变性及还原，除去非蛋白质杂质等。［操作步骤］通常采用方法：用含尿素裂解缓冲液直接进行抽提：用含去垢剂的缓冲液抽提后，经丙酮沉淀。3、第一向电泳：可采用传统的ampholine的pH梯度管状凝胶来进行；或具有固相pH梯度的IPG干胶条。4、平衡及二向间的转移：使蛋白质分子与SDS充分作用；两相良好接触。5、第二向电泳：SDS-PAGE2、蛋白质定量：第一向等电聚焦电泳仪两维间的平衡•一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于－80°保存数月。•但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE顺利进行。•建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。5.第二向电泳：SDS-PAGE6.蛋白质的检测及后续分析：考马斯亮蓝、银染、荧光标记、放射自显影；图像扫描，计算机数字化处理，确定蛋白质的等电点和分子量，建立蛋白质数据库，取出感兴趣蛋白质，进行质谱分析，进一步分析蛋白质分子的分子结构和组成。样品制备双向电泳样品制备基本原则•尽可能提高蛋白样品的溶解度（包括多数疏水性蛋白），抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；且制备方法应具有可重现性。保持蛋白样品全部处于溶解状态。•减少对蛋白质的人为修饰（如酶性或化学性降解等）。•完全去除样品中的核酸。（超声、核酸酶）•尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。增加样品溶解性的手段•变性剂：尿素和硫脲–通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域•表面活性剂：非离子和两性离子去污剂–经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS和SB3-10等•还原剂：二硫苏糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)–在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。增加样品溶解性的手段•起载体作用的两性电解质–即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀–Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。–另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。九楼蛋白质组平台第一向等电聚焦设备有两台ETTANIPGphorⅡ,能运行所有规格的IPG干胶条（7，11,13，18，24cm），一体化的冷却系统和电源精确控制温度和电压，可保证电泳过程中和每次电泳间的重复性，而且最多可同时走12条IPG胶条。第二向电泳设备包括高通量的可同时跑12块胶的ETTANDALTTWELVE系统（适合7-24cm任何长度的胶条）。中通量垂直电泳系统ETTANDALTSIX（可同时运行6块胶）先进的图象扫描分析系统，包括可进行荧光扫描的TYPHOON9400扫描系统（可将灵敏度提升至0.1ng)，IMAGESCANNERⅡ电泳扫描分析系统，先进的图象分析软件IMAGEMASTER。全自动的ETTANSPOTPICKER斑点切取工作站，可精确切取所选择的蛋白质斑点ETTANDIGGESTER自动蛋白酶解系统