硝化细菌的分离与鉴定

1硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2-→NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将氨直接转化为硝酸盐的细菌。氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～382℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0mg/L，低于0.5mg/L时硝化作用明显减弱。另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用活菌计数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用OD600测的值误差较大。氨转化效率和硝化作用强度主要用比色法测定，利用亚硝酸根的显色反应。亚硝化菌测定其培养液中亚硝酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。1材料和方法1.1实验材料1.1.1菌种由海洋中分离得到1.1.2培养基亚硝化菌培养基(NH4)2SO40.5gNaCl0.3gFeSO4•7H2O0.03gK2HPO41gMgSO4•7H2O0.03gCaCl27.5g蒸馏水1000mlPH自然固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基NaNO21gMgSO4•7H2O0.03gMnSO4•4H2O0.01gK2HPO40.75gNa2CO31gNaH2PO40.25g蒸馏水1000mlPH自然固体培养基加5％琼脂肉汤培养基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化钠0.5％琼脂2％1.1.3试剂牛肉浸膏上海长阳生化制药厂蛋白胨上海东海制药厂磷酸氢二钾浙江临平化工试剂厂磷酸二氢钠南京化学试剂一厂磷酸氢二钠南京化学试剂一厂氯化钠南京化学试剂一厂MnSO4•4H2O南京化学试剂一厂琼脂江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4）2SO4南京化学试剂一厂FeSO4•7H2O上海试剂二厂MgSO4•7H2O上海试剂四厂CaCl2华东师范大学化工厂Na2CO3上海虹光化工厂NaNO2淮安化工二厂磺胺酸天津瑞金特化学品有限公司α-萘胺上海泗联化工厂31.2实验方法1.2.1硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。1.2.2形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。1.2.3细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以上。每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。1.2.4硝化作用测定1.2.4.1试剂（1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕色瓶中。溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。（2）2%醋酸钠溶液将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。1.2.4.2方法☆标准曲线的绘制①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03mg/ml。4②吸取NO2-标准液（NO2-0.03mg/ml）0、1、2、3、4、5ml，分别放入50ml容量瓶中，每一容量瓶NO2-浓度为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μg/ml；各加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。③用分光光度计于520nm处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。☆培养液中NO2-测定①亚硝化菌氨转化作用测定取1ml培养液于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于520nm处比色。②硝化菌硝化作用强度测定取1ml培养液稀释100倍（视培养液中NO2-浓度而定），取稀释后的培养液1ml于50ml容量瓶中，加入1ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于520nm处比色。☆结果计算＠标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。回归得到方程y=ax+b＠亚硝酸根浓度=，mg/mld=稀释倍数1.2.5细菌浓度测定（1）取0.1ml培养液加到0.9ml生理盐水中，混匀，就得到10－1的菌悬液，再取出0.1ml加到0.9ml生理盐水中，得到10－2的菌悬液，同样方法依次稀释到10－3、10－4的菌悬液，具体情况视菌悬液浓度而定。（2）将稀释好的菌悬液取0.1ml，与冷却到50℃的琼脂培养基混匀，于24℃培养5天，进行计数。2结果2.1亚硝酸盐浓度测定标准曲线用亚硝酸根标准液，加入格利斯试剂，于752分光光度计上520nm处比色，以亚硝酸根浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。见图1。图1亚硝酸盐浓度测定的标准曲线Fig1Thestandardcurveofnitritedetection2.2硝化细菌的鉴定2.2.1形态结构鉴定—单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大；5硝化菌体积较小。与文献所述相同。见图2和图3。图2亚硝化菌的形态Fig2Themorphologyofsub-nitrobacteria图3硝化菌的形态Fig3Themorphologyofnitrobacteria2.2.2培养特征将挑选出来的菌落接种到肉汤琼脂培养基上，没有生长，可以认为该菌为自养菌。（硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长）2.2.3硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于24℃培养5天，在亚硝化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液取出1ml稀释100倍，加入格利斯试剂，于752分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量减少，可以断定为硝化菌。2.3氨转化作用和硝化作用2.3.1亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过5周的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度能上升到300μl/ml以上，说明其具有亚硝化作用。实验结果见图4。图4亚硝化菌的氨转化作用Fig4Theammoniaconversionofsub-nitrobacteria2.3.2硝化菌的硝化作用硝化菌经过10天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度下降40％左右。实验结果见图5。图5硝化菌的硝化作用Fig5Thenitrificationofnitrobacteria2.4硝化细菌的培养2.4.1发酵培养硝化细菌的pH值变化由于硝化细菌产酸，发酵罐中的pH值一直呈下降的趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。实验结果见图6。2.4.2发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有68％左右。在发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势，实验结果见图7。图6发酵罐培养硝化细菌的pH值变化曲线Fig6ThepHcurveofnitrobacteriacultivationinfermenter图7发酵罐培养硝化细菌的DO值变化曲线Fig7TheDOcurveofnitrobacteriacultivationinfermenter2.4.3发酵培养硝化细菌的生长曲线该生长曲线由发酵液活菌计数得到，横坐标为发酵6时间，纵坐标为含菌量的对数值。由该生长曲线可以看出硝化细菌和一般的异养菌的不同，硝化细菌的生长较缓慢，其对数生长期要5天左右才能到达，菌浓度也很低。实验结果见图8。图8发酵培养硝化细菌的生长曲线Fig8Thegrowthcurveofnitrobacteria3讨论3.1本研究的主要目的是筛选生长速度快、硝化作用强度大的硝化细菌。主要步骤如下：采集水样分离鉴定培养硝化作用测定菌种保存发酵培养细菌浓度测定3.2测定硝化作用强度的原理是：NO2-能与格利斯试剂反应生成紫红色化合物，此反应不受NO3-N的干扰。因此可通过比色测定出培养基中亚硝酸的含量。3.3在摇瓶培养和发酵培养的后期，菌的亚硝化率和硝化率都有所下降，可能的原因是培养液中的产物累积的太多，对亚硝化作用和硝化作用有抑制，特别是硝酸根对硝化作用的抑制，因此，对于硝化细菌最好采用连续培养。总之，随着水产养殖业的迅速发展，硝化细菌已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要作用已引起广泛的关注，可以说，启今日为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，几乎是不可能之事。硝化细菌作为生物硝化脱氨的主要微生物，由于其生长速率低，要想提高硝化细菌的工作效率，一方面要避免硝化细菌的流失，一般可做成固定化细胞，还有就是要富集培养，此外，对催化硝化细菌的酶也可以进行更多的研究。对硝化细菌的研究在这几方面还大有作为。