2014年大连市伤寒沙门氏菌耐药及分子分型研究

基金项目：大连市科技计划项目(编号:2012E13SF116)作者单位：1.大连市疾病预防控制中心微生物检验所，大连116021；2.大连医科大学基础医学院形态学教研室；3.广东省疾病预防控制中心微生物检验所,广东省应急病原学检测重点实验室作者简介：侯君（1976—），女，辽宁大连人，副主任技师，硕士，主要从事微生物检验工作2014年大连市伤寒沙门氏菌耐药及分子分型研究侯君1，陈玉凤1，栾明春1，王晓炜2，李柏生3,孙茂利1，于蕾1，薄志坚1，李瑞1摘要：目的了解大连市伤寒沙门氏菌耐药性及分子分型特点，建立沙门氏菌分子特征本底信息，为今后防治工作提供科学依据。方法采用微量肉汤稀释法对46株伤寒沙门氏菌进行8种抗生素敏感试验；运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法对46株伤寒沙门氏菌进行分子分型及聚类分析。结果46株伤寒沙门氏菌对萘啶酸(NAL)100%敏感，对氯霉素（CHL）和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMZ）耐药率为4.35%，对庆大霉素(GEN)耐药率为47.83%，发现多重耐药株一株；BioNumerics分析结果显示，46株伤寒沙门氏菌共产生30种PFGE带型，有7株表现为同一PFGE型别。结论大连地区存在耐庆大霉素的伤寒沙门氏菌；PFGE结果表明这些菌株存在遗传多态性，并有优势菌株的存在。[关键词]伤寒沙门氏菌；耐药性；脉冲场凝胶电泳ThedrugresistancestatusandmoleculartypingofS.typhoidstrainsinDalianin2014HOUJun,CHENYu-feng,LUANMing-chun,WANGXiao-wei,LIRui,YULei，BOZhi-jian，LIBo-sheng(DalianCityCenterforDiseaseControlandPrevention)Abstract：ObjectiveToinvestigatetheantibioticresistanceandmoleculartypesofSalmonellatyphiisolatedinDalian,toestablishthemolecularcharacteristicsbackgroundofSalmonellatyphi,toprovidescientificevidencesforfuturepreventionandcontrol.MethodsAbrothdilutiontechniquewasusedforsensitivityteston46strainsofSalmonellatyphito8kindsofantibiotics.Pulsedfieldgel-electrophoresis(PFGE)wasusedtoclassifyandanalyzethe46strainsofSalmonellatyphi.ResultsAll46strainsofSalmonellatyphiweresensitivetonalidixicacid.Thedrugresistancerateof46Salmonellatyphiwas4.35%forchloramphenicol,4.35%fortrimethoprim/sulfamethoxazoleand47.83%forgentamycin.Amultipledrugresistantstrainwasfound.Atotalof46isolateswereclassifiedinto30typesbyPFGEandonly7strainsofSalmonellatyphiwereclassifiedtothesametype．ConclusionsTherewereSalmonellatyphistrainsinDalianthosewereresistanttogentamycin.ThestrainsofSalmonellatyphiinDalianweregeneticpolymorphism,andthereweredominantstrains.Keywords:SalmonellaTyphi;antimicrobialresistance;Pulsedfieldgel-electrophoresis伤寒是由伤寒沙门氏菌引起的全身性感染性疾病，伤寒沙门氏菌经粪-口途径传播，人类是唯一传染源，伤寒病的发生与环境、食品卫生状况及饮食习惯密切相关。大连地区为沿海城市，居民一直有生食或半生食海产品的习惯。2014年我们从全市医院临床标本中分离和鉴定了伤寒菌株46株，较上年度增加了76.9%。为了解这些菌株的抗生素耐药情况和相互之间的遗传联系，更好开展监测和防控工作，对其进行药敏试验和脉冲场电泳分子分型研究。结果如下：1.材料与方法：1.1材料1.1.1菌株：本实验所用46株伤寒沙门氏菌均来自2014年大连市各医院自伤寒患者中分离到的临床分离株；1.1.2诊断血清:沙门氏菌A-F多价血清、O血清群、Hd、Vi血清（泰国S&A公司）；1.1.396孔药敏板购自天津金章科技发展有限公司,按规定贮存并在有效期内使用；1.1.4质控及标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922(大连市疾病预防控制中心菌种室);PFGE分析用分子量参考标准菌株Braenderup血清型全球参考菌株H9812[1](中国疾病预防控制中心)。1.1.5分子分型主要仪器及试剂：美国Bio-Rad公司的脉冲场凝胶电泳仪（CHEFMAPPERTM）和凝胶成像仪（GelDocTMXR+）；德国Eppendorf核酸蛋白测定仪（BioPhotometer）。1.2方法1.2.1血清学分型:进行沙门氏菌A-F多价血清、O血清群、H抗原、Vi抗原血清凝集实验[2]1.2.2微量肉汤稀释法：药敏实验采用美国临床标准委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，定量测定伤寒沙门氏菌最低抑菌浓度（MIC）。根据大连市2014年细菌耐药检测方案选择以下8种抗生素：四环素（TET）、环丙沙星(CIP)、萘啶酸(NAL)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GEN)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMZ）、氯霉素（CHL）。药敏结果判读参照美国临床实验室标准化协会(CLSI，2012年版)标准进行。1.2.3脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型：菌株参照PulseNetChina技术手册之脉冲场凝胶电泳（PFGE）操作规范中“大肠埃希菌、沙门氏菌和志贺氏菌脉冲场凝胶电泳实验方案”进行操作。用限制性内切酶XbaⅠ进行酶切，电泳参数：初始转换时间为2.16s；终末转换时间为63.8s，电泳时间为18h。1.3统计学分析：电泳图谱以H9812为统一的分子量标准进行校准确定条带位置。将实验获得的PFGE电泳图谱用BioNumerics6.6软件进行数据分析，识别图形条带，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）进行聚类，构建聚类树，采用Dice系数来量化不同菌株间的亲缘关系。2.结果2.1血清学检验结果：46株沙门氏菌血清型均为O9,12Hd，为伤寒沙门氏菌。2.2药敏试验结果46株伤寒沙门氏菌对萘啶酸(NAL)100%敏感，对氯霉素（CHL）和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMZ）耐药率为4.35%，对庆大霉素(GEN)耐药率为47.83%。发现双重耐药株两株；发现多重耐药株一株，该伤寒沙门氏菌除了对萘啶酸(NAL)敏感，对其他7种抗生素均耐药。具体情况见表1：表1.2014年大连市46株伤寒沙门氏菌对8种抗生素的耐药性抗生素名称敏感中介耐药菌株数百分率（%）菌株数百分率（%）菌株数百分率（%）四环素（TET）4597.830012.17环丙沙星(CIP)4597.830012.17萘啶酸(NAL)46100.000000头孢西丁(CFX)4597.830012.17头孢噻肟(CTX)4597.830012.17庆大霉素(GEN)2452.17002247.83甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMZ）4495.650024.35氯霉素（CHL）4291.3024.3524.352.2PFGE指纹图谱分型结果对46株伤寒沙门氏菌DNA经XbaⅠ酶切电泳后，每株产生12-19条电泳条带不等。根据电泳条带的位置和数量的不同，共分为30个型别（相似性100%的为同一PFGE型别）。其中优势条带有9种，Sal-08型7株，Sal-16型和Sal-25型各3株，Sal-05型、Sal-06型、Sal-07型、13型、19型、24型各2株。聚类分析结果显示，46株之间相似系数在58.1%-100%之间。结果见图1：图146株伤寒沙门菌PFGE聚类分析图谱3.讨论伤寒是我国法定乙类传染病之一,由于其传染性强、病程长、易复发、并发症多、疾病负担较重，而受到广泛关注[3][4]。本试验对大连市2014年临床分离的伤寒沙门菌46株,用8种抗生素对其进行抗生素敏感试验。结果表明:46株沙门菌对实验选取的抗生素敏感性较高,除了庆大霉素(耐药率为47.83%),对其他7种抗生素几乎均敏感。庆大霉素为国产药物，来源广泛，价格中等，对伤寒沙门氏菌敏感性高[5][6]而一直被广泛使用。此次研究表明，大连市伤寒沙门氏菌对庆大霉素耐药比较严重，提示临床用药应引起重视。氯霉素因为价格低廉,疗效好,为治疗伤寒的首选药物,一度造成严重的耐药,本研究显示氯霉素耐药率不高，与张雯霞等[4]的研究一致,可能由于伤寒沙门氏菌对多年来不使用的抗菌药物恢复了敏感性。本次实验发现一株多重耐药菌株，提示了多重耐药菌株在临床实践中的存在，临床上应更多关注药敏实验结果以正确选用抗生素，减少耐药菌株特别是多重耐药菌株的出现。自PFGE方法问世以来,十几年间得到了长足的发展,因其具有更好的区分能力,且重复性好、结果稳定、易于标准化。目前被认为是细菌的分子流行病学研究的“金标准”,在探明传播途径、追踪传染源方面发挥了重要作用。本次实验根据电泳产生的条带位置和数量的不同,可将46株伤寒沙门菌分为30个PFGE型别，与林一曼等的研究相似[7]。表明PFGE是一种区分力很强的方法，能显示菌株间细微的差异，尤其适用于伤寒沙门氏菌这样具有相同血清型的细菌间的同源性分析。可以帮助确定病例之间的亲缘关系,并及时确认和处理在大范围内、呈散发特征的爆发事件。聚类分析结果显示46株菌之间相似系数在58.1%-100%之间，且产生了30个型别，表明大连地区伤寒沙门氏菌存在遗传多态性，即该菌在本地区的流行存在多个克隆系；其中Sal-08型共有7株，远多于其它型别，对照流行病学资料，未发现其相互之间的联系，提示在多个克隆系存在的同时，优势菌株的存在。本地区伤寒沙门氏菌的遗传多态性与优势菌株群出现的关系尚待进一步监测，14019号菌株为多重耐药株，同时也是PFGE分型条带最多的菌株（19条），与其他聚类群亲缘关系远（67.7%），多重耐药性与PFGE分型分析之间的联系尚待研究[3]。参考文献[1]HunterSB,VanterinP,Lambert-FairM,etal.Establishmentofuniversalsizestandard,starinforusewiththepulsenetstandardizedpulse-fieldgelelectrophoresisprotocols:convertingthenationaldatabasestothenewsizestandard.JClinMicrobiol[J],2005,43(3):1045-1050.[2]卫生部疾病预防控制局，中国疾病预防控制中心.伤寒、副伤寒防治手册[M].2版.北京：人民卫生出版社,2006.[3]罗芸,叶菊莲,徐宝祥,等.浙江省伤寒副伤寒沙门菌耐药及分子分型[J].中国公共卫生，2010,26(3):328-330．[4]张雯霞，陈敏，张曦，等.2008年－2010年上海市部分伤寒副伤寒沙门菌耐药分析及分子分型[J].中国卫生检验杂志,2012,22(2):285－