糖基转移酶和糖苷酶

TOOLSFORGLYCOBIOLOGY第八章糖基转移酶和糖苷酶TOOLSFORGLYCOBIOLOGY第一节糖基转移酶(Glycosyltransferases)糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶。负责将活性供体(通常是NDP-糖)的单糖转移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完成糖基化反应。目前发现的糖基转移酶有100多种，其主要分布在内质网和高尔基体。TOOLSFORGLYCOBIOLOGYTOOLSFORGLYCOBIOLOGYTOOLSFORGLYCOBIOLOGY一、糖基转移酶的命名与分类糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖类型进行分类的。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。另外一种方法是根据序列的同源性、底物/产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。这种分类法糖基转移酶被分为66个家族及一个未分类族。所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个超家族，分别为GT-A和GT-B超家族。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的命名GlcNAcT-I的全称为：UDP-N-乙酰葡糖胺:-3-甘露糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。GlcNAcT-II的全称为：UDP-N-乙酰葡糖胺:-6-甘露糖基-1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY-1,4-GalactosyltransferaseFamilyTOOLSFORGLYCOBIOLOGYFucosyltransferaseFamilyTOOLSFORGLYCOBIOLOGYAllmembersofthesialyltransferasegenesclonedTOOLSFORGLYCOBIOLOGYTheEvolutionaryHistoryofGlycosyltransferaseGenes后生动物后口动物脊椎动物哺乳动物原始昆虫无脊椎动物非哺乳动物TOOLSFORGLYCOBIOLOGY二、糖基转移酶特性一个基因一种转移酶一种连接键糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶特性糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即较短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内质网或高尔基体膜，长的C-端在内质网或高尔基体的管腔内。有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较短的N-端在内质网腔，而很长的C-端则定位于胞浆。TOOLSFORGLYCOBIOLOGYBiologicalFunctionsofaSolubleFormofN-acetylglucosaminyltransferaseV(GnT-V)TOOLSFORGLYCOBIOLOGYRegulationofHighBranchinginN-linkedOligosaccharidesTOOLSFORGLYCOBIOLOGYTOOLSFORGLYCOBIOLOGY大鼠不同组织中三种Ｎ-乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAcT)组织活力(pmol／mg蛋白·h)GlcNAcT-IIGlcNAcT-IVGlcNAcT-V肾18403301.91.6306脑660488.70.7381胃5001508.20.7251小肠28099171.56811肺1044.62.60.7384脾1002.5208212睾丸522.98.20.8374心111.19.41.4101肝810.92.80.78.20.8TOOLSFORGLYCOBIOLOGY三、糖基转移酶的结构域属于II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个结构域。氨基端的胞浆域，一般少于25个(最少4个)氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；颈区域，位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的结构域催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状，约含310-430个(最长可达720个左右)氨基酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域TOOLSFORGLYCOBIOLOGY四、糖基转移酶的催化特性与功能(1)底物专一性糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。对底物专一性，一个酶的产物常作为下一个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的特定顺序。因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用的供体和受体也不同。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的催化特性合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合成淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素时是GDP-Glc。对受体的专一性，在糖蛋白的N-糖苷键连接的糖链的外周有6种不同的方式连接的N-乙酰葡糖胺(GIcNAc),它们连接在不同甘露糖基(Man)的不同糖基上，分别有6个不同的糖基转移酶负责它们的转移，每个酶又对应不同的受体。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同TOOLSFORGLYCOBIOLOGY人B血型的1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的催化特性唾液酸化LewisX四糖抗原合成时，一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，再由-1,3FucT在G1cNAc上加入Fuc，而不能先合成岩藻糖化的N-乙酰乳糖胺后再加上NeuAc。因-2,3NeuAcT不能以-1,3岩藻糖化糖链为底物。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的催化特性糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末端标记(荧光和放射性核素)的底物。不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的底物。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的催化特性(2)二价金属离子的需求大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为辅助因子，缺乏二价金属离子时(如在EDTA存在下)酶活力很低或丧失。二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其次是Co2+,Mg2+,Ni2+。糖基转移酶T-V不需要二价金属离子。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY五、糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶在结构上的最大特点是不同糖基转移酶一级结构之间的同源性很少，即使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同源性。血型A抗原的GalNAcT和血型B抗原的GalT同源性达99％，在353个氨基酸残基中只有4个不同。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶同源性和抗原性不同种属中同一糖基转移酶的同源性极大，其催化结构域的同源性一般均在80％以上。如人、小鼠和兔中-1,2GlcNAcT-I四个结构域的同源性分别为100%、90%、80%和95%。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY六、糖基转移酶和疾病-1,3T的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应。相反，如果人体内-1,4半乳糖基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白G(IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低。它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，其症状是类风湿。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如糖链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而间接关系到癌瘤发生和发展。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高，就会产生癌变，同时出现早期的分化抗原。多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志。这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步侵入。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病与肝癌发生有关的糖基转移酶糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和-1,6岩藻糖基转移酶。GnT-Ⅳ和GnT-Ⅴ能将一个N-乙酰葡糖胺转移至N-糖链五糖核心1,3和1,6臂甘露糖上,分别形成-1,4和1,6键，使N-糖链天线数增多，-1,6FucT则将岩藻糖转移至糖链最内侧(与天冬酰胺相邻)的N-乙酰葡糖胺上形成核心岩藻糖。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶和疾病这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白上，使肿瘤细胞表面性质变化，导致细胞粘附、侵袭和迁移能力改变，是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY七、糖基转移酶的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、预防方面有重要意义。将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化,产生不同糖型，通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结合，比较转染组和非转染组糖蛋白改变，从而确定蛋白质和糖基化的功能关系,研究为糖基化改变在肝癌发生中的作用研究奠定了基础。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的应用采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化改变，并从结构上描述糖链，旨在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶点。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶在糖类合成中的应用糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。现在普遍使用的糖类合成方法有两种：化学合成和酶促合成化学合成近年来取得一些进展，提出了一种全自动寡糖合成法，但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。酶促合成的产量高、产物具有特异立体化学异构性。糖基转移酶的应用TOOLSFORGLYCOBIOLOGY糖基转移酶的应用糖基转移酶可作为研究糖复合物工具如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰等。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY八、O-GlcNAc糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系合作。O-GlcNAc糖基化修饰起到调节蛋白质的活性，在生命过程的许多方面起作用(如核运输，基因转录及翻译过程)。OGT基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的O-GlcNAc糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY细胞质和细胞核内的蛋白质O-GlcNAc糖基化和去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)和O-GlcNAc糖苷酶催化。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之一。其研究目的：用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的方法从这两个系统提纯重组OGT，获得制备有活性的OGT，用于进行O-GlcNAc糖基酶功能方面的研究。TOOLSFORGLYCOBIOLOGY研究结果用大肠杆菌和Hi5昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组OGT。携带人OGTcDNA的PET32a质粒在大肠杆菌中表达出带有1个S-Tag的重组人OGT融合蛋白，然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到OGT融合蛋白。其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具有生物