15第十五讲蛋白质组学(二).

第十五讲蛋白质组学（二）第一节概述第二节蛋白质组学研究技术一、二维凝胶电泳技术二、质谱技术三、酵母双杂交体系四、蛋白质芯片技术第三节蛋白质组学的应用和发展趋势第二节蛋白质组学研究技术二、质谱技术1、概述：•质谱技术–按照离子的核质比（m/z）对离子进行分离并鉴定的方法。–质谱技术诞生于20世纪初，一直应用于有机小分子领域．–直到20世纪80年代才渐渐进入到生物大分子领域。•质谱技术在蛋白质组研究中的作用–在蛋白质组学研究中，蛋白质鉴定是最关键的一环。–质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组研究的主要支撑技术。–对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分子质量。–通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质研究。2、质谱仪的工作原理•基本原理–分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分离，根据不同离子质荷比(m/z)的差异，对离子进行分离并确定分子质量。•质谱仪组成：–进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析等–离子化源和质量分析器是两个核心部件•质谱仪分类：根据两个中心部件可以分为–电啧雾(ESI)–快原子轰击质谱(FAB)–飞机时间质谱–四极杆质谱•工作原理–不同离子源和质量分析器相匹配——基本确定了质谱仪的工作原理和方式。–如：ESI离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配–如：基质辅助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，（MALDI-TOF-MS）。质量分析器离子化源2、常用生物质谱的类型和特点（1）电喷雾质谱仪（ESI-MS）电喷雾离子化(elcctrosprayionizationESI)：一种“软电离”方式将样品溶解，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，微滴溶剂蒸发，微滴表面的电荷密度随半径减小而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，实现样品的离子化。ESI过程图解（引自理查德J.辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南,2006）ESI离子化过程特点：ESI-MS是一种典型的“软离子”方式没有直接的外界能量作用于分子，分子结构破坏较少。可以监测大分子质量的分子电喷雾质谱可形成多电荷离子，在较小的m/z范围内可以监测到大分子质量的分子。测定分子质量范围可测定分子质量10,0100Da以下的蛋白最高达15,01OODa马心肌红蛋白(分子质量16951.5Da)的假想ESI质量图谱（引自理查德J.辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南,2006）带不同电荷蛋白质的（理想）质谱图。常见的以电喷雾为离子化方式的质谱仪：电喷雾-三级四极杆质谱(ESI-Q-MS)电喷雾-三级四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)电喷雾-傅里叶回旋共振质谱(ESI-FTUCR-MS)液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)液质联用(LC-MS)：电喷雾质谱采用液相方式进样，可与液相色谱联用。蛋白质或多肽经HPLC分离，直接进入质谱仪进行分子质量测定。T11：lycopeneLC-ESI-MS测定类胡萝卜素四级杆分析器结构四级场（见下图）原理：在一定的Vdc和Vrf下，只有一定质量的离子通过四级场，到达检测器在一定Vdc和Vrf下，改变Vrf可实现扫描特点：扫描速度快，灵敏度高四根棒状电极，形成四级场1、3棒+(Vdc+Vrf)2、4棒–(Vdc+Vrf)时间飞行质谱分析（TimeofFlightAnalyze）特点–仪器结构简单，不需要磁场、电场等；–扫描速度快，可在10-5s内观察到整段图谱；–无聚焦狭缝，灵敏度很高；–可用于大分子的分析（几十万原子量单位），在生命科学中用途很广；(2)基质辅助激光解吸离子化质谱MALDI（matrix-assistedlaserdesorptionionization）将样品包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，将一部分能量传递给样品分子使其离子化。激光解吸基质的重要性早期—激光解吸离子化没有基质辅助，激光能量直接作用于被分析物，使分子碎裂，产生大量碎片，而不易得到分子离子。1988年，Tanaka等采用可吸收激光的基质（如甘油）包埋被分析物，避免激光对分子结构的破坏，测定蛋白分子质量为35kDa进一步采用固体基质使样品分散得更均匀，离子化效果更好。通常采用的激光束波长为337nm，样品的电离过程是由基质介导的，基质对分析的灵敏度、分辨率和精确度有很大影响。常用的基质有（对于蛋白质和多肽样品）芥子酸(SA)、d-氰基-4羟肉桂酸（CHCA）、2,5-二羟基苯甲酸（DHB）等。MALDI主要特点离子电荷数通常为1～2，不形成复杂的多电荷图，对图谱解析比较清楚、简单。如：乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图。固相进样方式，不受溶液性质的影响，对杂质的忍耐性较好。生物样品制备时在样品中引入去垢剂效果更好。(如尿素和SDS)等乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图常见质谱仪：基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱MALDI-TOF-MSMALDI-TOF/TOF—MS基质辅助激光解吸离子化三级四极—飞行时间质谱MALDI-Q-TOF-MS3、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴定技术肽质量指纹图谱(peptidemassfingerprinting，PMF)蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不相同，肽混合物质量数亦具其特征性，经质谱分析得到是图谱称为指纹图谱，应用：蛋白质鉴定在蛋白质数据库中，寻找具有相似肽指纹图谱的蛋白质。酶切蛋白质，质谱分析得到PMF，检索数据库进行鉴定。PMF鉴定蛋白质基本路线蛋白质的肽谱的特点肽谱测定仪器：最有效的质谱仪：MALDI-TOF-MS灵敏度高，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段。肽谱鉴定特点：若蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸被修饰（如半胱氨酸烷基化、甲硫氨酸氧化），蛋白质PMF就会有一些质量数与理论值不符，PMF鉴定的不需要将全部肽质量数都与理论值相符。PMF方法可同时处理许多样品，是大规模鉴定的首选方法。举例：PMF鉴定双向电泳分离蛋白质的实例，如下图（Next）：来源于人白血病细胞的蛋白质，胰蛋白酶酶切，得到PMF，经数据库检索鉴定为人丙酮酸激酶。图中标有“*”峰：能与数据库中肽质量数理论值相符的。蛋白质的PMF2D凝胶上蛋白点的PMF丙酮酸激酶“*”与数据库相符人白血病细胞4、串联质谱技术概念：指用质谱作质量分离的质谱分析方法。也称质谱-质谱法，多级质谱法，二维质谱法和序贯质谱法。如：磁分析器-静电分析器-磁分析器的串联特点：自动化程度、敏感性，高通量分析如：二维色谱—串联质谱(2D-HPLC/MS)优点：可大规模分离鉴定蛋白质，在鉴定膜蛋白、低丰度的蛋白质及大分子蛋白质等方面显示出独特的优势，缺点：串联质谱技术得到的肽序列图谱相对复杂，从图谱进行完整的序列分析难度较大。如：肽序列标签技术(peptidesequencetag，PST)肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的已知序列的多肽标签。已知氨基酸序列亲和标签+离子质量（2H）+蛋白质结合部位三者构成PSTPST和蛋白质结合，酶切，亲和分离，质谱分析，数据库检索鉴定蛋白质的方法。解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。三、酵母双杂交技术1、概念：依据生物体转录激活过程，在酵母细胞内建立的研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的有效体系和方法。1989年，Fields等正式建立了酵母双杂交(veasttwo-hybrid)体系，又称为“相互作用陷阱”。2、酵母双杂交的原理：依据生物体转录激活过程建立的，先理解转录激活因子的激活过程转录激活因子的结构特点真核生物的位点特异性转录激活因子具有两个独立的结构域两个独立的结构域，各具功能，互不影响•DNA结合结构域(DNAbindingdomain，BD)•转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain，AD)激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无激活功能激活因子对基因表达的激活不同来源激活因子的BD区和AD区结合后AD和BD两种结构域的上游活化序列相互接近特异性地激活BD结合的基因，激活转录过程，基因表达依据这一原理，建立了酵母双杂交体系转录激活因子的结构和转录的激活2、酵母双杂交的原理：研究“X蛋白”和“Y蛋白”是否发生相互作用？将蛋白质X的基因与特异的BD基因融合，成为“诱饵”蛋白蛋白质Y基因与特异的AD基因融合为“猎物”蛋白编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时若蛋白质X和Y之间存在相互作用，报道基因表达。若蛋白质X和Y之间不存在相互作用，报道基因不表达。酵母双杂交系统原理示意图3、酵母双杂交系统的组成和特点（1）三个部分组成①BD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称诱饵蛋白②AD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称靶蛋白③有一个或多个报告基因的宿主菌株常见报道基因E.coliLacZ基因，蓝白菌落筛选营养缺陷型筛选发光蛋白的基因（GFP）•操作程序：①克隆诱饵蛋白基因②克隆靶蛋白基因③构建BD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白④构建AD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白⑤载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞⑥细胞培养，观察报告基因的表达情况⑦判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用情况（2）为何构建酵母双杂交系统–酵母细胞便于转化，结果易于筛选；–选择性好。•内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞靶蛋白结合，•避免了对文库编码蛋白质的干扰。（3）酵母双杂交系统的发展–反向双杂交体系：•用于鉴定影响蛋白质间相互作用的化合物，•在药物研究开发方面具有十分重要的应用价值。–三杂交体系：•对双杂交体系的一个有益补充，•用于研究多种蛋白质之间的相互作用。（4）双杂交系统的优势？融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行。蛋白质能保持天然的折叠状态，类似人体的生理状态。证实蛋白质间的相互作用更接近于体内的真实水平。正是其他体外生化检验方法所缺乏的。筛选cDNA文库中编码的，与已知蛋白质特异作用的，成分。揭示许多已知蛋白质之间的未知作用。有助于发现（许多）新基因。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生，不需要纯化蛋白。能检测到短暂的相互作用，广泛应用于信号通路的研究。（5）酵母双杂交系统的局限性①只研究在核内表达的蛋白质的相互作用②融合蛋白的构建可能影响蛋白质本身的活性或折叠状态；③如果特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生，则不能检测到修饰后蛋白质的相互作用；④许多蛋白质与BD融合，具有自激活效应，导致假阳性结果。四、蛋白质芯片技术1、概念蛋白质芯片（proteinchip）：又叫蛋白质微阵列（proteinmicroarray）是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片。将大量纯化的蛋白质有规则的固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。蛋白质芯片技术依据蛋白质之间的相互作用的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的特定蛋白质分子进行高通量分析检测的方法。是在蛋白质水平上，了解和研究，各种生命现象本质的重要方法。蛋白质芯片检测示意图2、基本原理将各种蛋白质（探针）有序地固定于载体上，制备蛋白芯片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。利用蛋白与分子之间相互作用的原理，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分（报告分子）与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去。利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质功能。4、分类：根据用途的不同，可分为蛋白功能芯片：（用于研究）将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析可用来进行蛋白