18-硕士研究课-现代分子生物学-电子克隆-胡忠

电子克隆电子克隆：electroniccloning----硅片克隆Insilicocloning----电子杂交electronichybrid电子克隆：定义：利用计算机技术，依托现有的网络资源EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等，采用生物信息学方法(包括同源性检索、聚类、序列拼装等)延伸EST序列，以期获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。ESTwalking基于染色体DNA序列的电子克隆1、EST(expressedsequencetag)---表达序列标签定义：指从不同组织来源的对应于mRNA的cDNA文库中随机挑选克隆进行5’或3’端测序后得到的部分cDNA序列，长度一般在300～500bp。EST技术是基于cDNA文库基础上的cDNA克隆的部分序列测定。EST技术的步骤：①构建cDNA文库②随机挑选cDNA克隆③碱裂解法或扩增制备模板④序列分析⑤与同种和异种生物已知的核酸和蛋白数据库进行比较分析⑥新基因及未知基因的基因库(GeneBank)登录2、电子克隆的方法和策略1）方法选择感兴趣的EST作为查询探针，对EST两端进行测序；根据两端序列查询dbEST数据库，找到部分重叠的EST同源序列，进行拼接、得到EST重叠群(ESTcontig)；(以长度≥100bp，同源性50%以上、85%以下为标准)以拼接好的ESTcontig为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，获得全长的基因编码序列。获得的EST序列数据，与GenBank核酸数据库进行相似性检测；假如没有精确匹配基因，将EST序列数据按EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。可根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。5’3’estSearchinestdatabaseSearchinestdatabaseSearchinestdatabaseSearchinestdatabase5’3’CompletecDNA简单电子克隆模式图estwalkingestwalking的技巧1.如何鉴定片段重叠和筛选最佳目的est2.选择合适的片段用于检索est文库EST同源性分析AU184451RICR2584A99AS825D004D07C25822RICS1291AAAAAAAD004D07AAAAAA99AS825AU184451RICR2584AC25822RICS1291AATGTAARicerootOryzasativacDNAcloneR2345,mRNAsequenceestwalking的优点和局限优点：快速，无须实验操作局限：1.est库不均一；2.est库测序精度不高（最高为97%）3.est库中有不完全剪切产物CLONEINFOCloneId:S20127_2ZDNAtype:cDNARIMERSPolyATail:UnknownSEQUENCEGATATGCGGCTANTATAGCCAGCATGCCATATGAGGGGCTTTTAGCATTAGAAGAGCAGATTGGNGATGTAAATACTGGTCTGGCAAAAAGCTACATTGTAGAGAAATTGAAGACTAGCTTATTTGTNCCAGGATCATCCTGCATGTCTAATAAGTCTTCTGAATCTTCCATGGAGAATGATGCTTGCATAATATGCCAGGAAGAGTATCAGGTTAAAGAATGCATTGGAACCCTTGACTGTGGCCACAGGTACCACGAAGATTGCATAAAACAATGGTTGATGGTAAAGAATTTATGCCCCATCTGCAAGACGACAGCTTTGTCAACCGGAAGAAGAAGTGGATAACGAACAGGAATAATCTTATTAGTTATTTACTTCCGACAAATATTCAGCTCAATTTTGTATATAAGAAACGGTAGACCATTCTGCTACCTGTATTTGTTGCTCACTTTGTTGTGATCCGGGAGTAACTCAGCTTCCTAAACTGTACAGCCATAACATTGATCATTTTCTTCGGTGTAGAATATTTTAAATTACTCAGTTCGCCCCCATCTGTATCATAAGGCGGACCGACAAAAAAACTCACAATGTCATTTCTAGGCAAACATTGTATCTACCATCAGATTAAAAATCAGAACAGAACATGTGCTCTTCTGTNCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGenomicDNA***cDNAest,partialcdsSearchingenomicsequencedatabaseGenomicsequenceofestgeneannotationHomologsearchbasedona.asequenceSearchinestdatabaseCorrectannotatedgenebyestandhomologpredictedgeneDesign5’-,3’-primersbasedonpredictedsequnceRT-PCRforcDNAcloningandsequencing结合氨基酸序列同源性分析的电子克隆esthomologa.ahomologGeneannotationpredictedgeneEST同源序列氨基酸同源分析基因分析推导的基因GenomicDNASequenceSource://btn.genomics.org.cn/rice电子克隆常用网址常用资源网址NCBI://://://://://gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.htmlTigem'sESTmachine://gcg.tigem.it/BLASTEXTRACT/estextract.htmlTHC://://bbrp.llnl.gov/bbrp/image/WEBSITEFORGENEPREDICTION://://氨基酸同源性分析2）基因分析的结果大致有三种：第一是已知基因，是研究对象为人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。新基因和未知基因将进一步用于生物学研究。基于染色体DNA的电子克隆优缺点优点：1.充分利用现有的信息资源A.基因组测序结果B.其他物种的est，cDNA信息2.基因组测序精度远高于est测序精度基于染色体DNA的电子克隆优缺点缺点和局限:1.必须经实验验证2.不适用以下种类的基因预测A.种间保守性差的基因B.外显子数目多而且每个外显子短的基因3）电子克隆获得的基因的真实性•若待测生物的基因组文库尚未构建，可将未知的EST片段在模型生物EST文库中进行电子克隆，可以获得模型生物中相关的完整cDNA序列和该序列所编码的氨基酸顺序。根据待测生物的偏爱密码子反推合适的碱基顺序，设计引物进行RT-PCR，对扩增出来的片段测序修正。•若待测生物基因组文库已经构建，将未知EST在自身的基因组文库中电子克隆，获得的片段与上述模型生物cDNA片段比较同源性。同时根据“GT……AG法则”推测内含子序列。将可能的外显子拼接，推导出6种可能的氨基酸序列，结合氨基酸同源性分析，以保证基因的真实性。4）电子克隆获得的基因的完整性•待测生物基因组文库尚未构建，只能根据真核生物cDNA的5’端为Hognessbox，3’端为Poly（A）的原则获得ORF的资料，侧翼序列资料的获得要用传统的实验方法。•基因组文库已经构建或部分构建，在克隆分析中就可以获得ORF以外的侧翼序列。如有因基因组文库不完全构建而存在的空缺，则结合模型生物cDNA片段进行分析补齐，以保证基因的完整性。5）电子克隆的作用•电子克隆避免了繁琐，高消耗，存在污染问题等的传统杂交实验操作，大大地提高了分离基因的效率。•可以跳过生物分类学的界限，从生物模型的已识别基因迅速克隆出其它生物基因组中相应的未知基因。3、电子克隆研究进展《人类新基因的电子克隆、实验确认与功能研究》：电子克隆到100个人类新基因，具有典型基因特点和一定功能结构域，其中23个基因被GenBank接受并被国际人类基因组组织(HUGO)基因命名委员会批准。（2002年）电子克隆与其它方法结合：最近发展起来的mRNA差异显示技术、抑制差减杂交技术和基因表达系列分析技术由于其操作相对简便、效率高，已成为功能基因克隆的重要手段，在许多实验室得到应用。但其主要缺点是得到的cDNA都不是全长cDNA，必须通过cDNA文库筛选或RACE的方法才能获得全长cDNA，进一步用于基因的功能分析和转基因研究。