20121015(终版)第十四章长期毒性作用及其试验方法

2020/1/14任立群1第十四章长期毒性作用及其试验方法long-termtoxicityimpactandtestmethod2020/1/14任立群2第一节基本概念和目的第二节试验设计原则及方法2020/1/14任立群3第一节基本概念和目的2020/1/14任立群4长期毒性作用是指药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物所产生的有害作用。为观察这种有害作用而设计的毒理学试验称之为长期毒性试验。一、定义急性毒性试验是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反应而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或24小时内多次给予受试药物后，一定时间内所产生的毒性反应。2020/1/14任立群5123给药的期限不同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2020/1/14任立群6根据给药期限的长短，可分为：亚慢性毒性试验——给药期限不超过90天或不超过试验动物平均寿命的10%；慢性毒性试验——给药期限超过90天或超过试验动物平均寿命的10%；终生毒性试验数代毒性试验2020/1/14任立群7123给药的期限不同给药的剂量范围不同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2020/1/14任立群8蓄积作用(accumulationaction)当较长时间连续、反复给药时，或者说给药的时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力，就会出现药物进入机体的速度(或总量)超过排除的速度(或总量)的现象，此时药物就有可能在体内逐渐增加并贮存起来，即蓄积作用。2020/1/14任立群9蓄积作用的表现形式作用量积蓄功能性蓄积2020/1/14任立群10123给药的期限不同给药的剂量范围不同观察的毒效应不同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别2020/1/14任立群11急性毒性试验是以死亡为观察终点的质反应过程长期毒性试验重点观察体重、血液生化等量反应指标（量变→质变）2020/1/14任立群12二、目的与意义2020/1/14任立群131预测受试物可能引起的临床不良反应2判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织提示临床试验中需重点监测的指标43推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围为临床试验中的解毒或解救措施提供参考5长期毒性试验的目的2020/1/14任立群14第二节试验设计原则及方法2020/1/14任立群15一、一般原则和要求基本原则全面、严谨、合理整体性随机、对照、重复2020/1/14任立群16一、一般原则和要求基本原则整体性长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。2020/1/14任立群17一、一般原则和要求选用两种实验动物三个剂量给药途径应与临床拟用途径相同基本要求2020/1/14任立群18一、一般原则和要求至少在两种动物体上进行，兼顾雌雄性别。选用两种实验动物基本要求2020/1/14任立群19一、一般原则和要求三个剂量剂量至少分为高、中、低三个档次。高剂量组应能充分反映药物的毒性，低剂量组不出现毒性反应。同时设一溶剂(或赋形剂)对照组或已知药物毒性对照组。基本要求2020/1/14任立群20一、一般原则和要求给药途径应与临床拟用途径相同口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为每天1~2ml/100g，也可将受试药物混在饲料或水中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时间内服入。静脉注射大鼠时可采用腹腔或皮下代替，各剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作说明。基本要求2020/1/14任立群21理想动物的标准：对受试物的生物转化与人体相近；对受试物敏感；已有大量历史对照数据。二、实验动物2020/1/14任立群22☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物2020/1/14任立群23☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物Wistar大鼠SD大鼠2020/1/14任立群24☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物一类新药：Beagle犬二类新药：杂种狗2020/1/14任立群25☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物☆在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。☆如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。2020/1/14任立群28Beagle犬：原产英国，纯种小猎兔犬Beagle犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强缺点：价格昂贵2020/1/14任立群292.起始月(周)龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物2020/1/14任立群302.起始月(周)龄二、实验动物长期毒性试验的给药期限较长；1原因：处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；2年龄较大的动物反应性降低,存在许多自发性疾病干扰试验结果。3一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。2020/1/14任立群31啮齿类动物最好在断奶后不久即开始给药大鼠起始周龄要求在4~9周龄；犬的起始月龄为4~9月龄，一般不超过12月龄；如选用杂种狗，起始年龄可稍大些。二、实验动物2.起始月(周)龄2020/1/14任立群32起始体重应在体重均值±20%的范围内。二、实验动物2.起始月(周)龄2020/1/14任立群333.性别及数量（1）性别二、实验动物☆一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中雌雄性别的动物数必须一致。2020/1/14任立群34在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要选用敏感性别的动物进行试验。二、实验动物3.性别及数量（1）性别2020/1/14任立群35超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8~10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组6只（雌雄各3只）；二、实验动物3.性别及数量（2）数量2020/1/14任立群36超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8~10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组6只（雌雄各3只）；二、实验动物3.性别及数量（2）数量《指导原则》：一般大鼠为雌、雄各30只，Beagle犬或猴各3~6只。2020/1/14任立群37恢复期观察的动物数；给药期的长短，过长，试验过程中的自然死亡动物数。注意2020/1/14任立群384.饲养管理严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素是非常重要的。二、实验动物2020/1/14任立群39酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度光照通风条件饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物2020/1/14任立群40光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物适宜温度为18~26℃。相对湿度为40%~70%。光照宜持续12h明亮，12h黑暗。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。2020/1/14任立群41光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物啮齿类动物雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过5只2020/1/14任立群42酮症酸中毒4.饲养管理二、实验动物犬光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素单笼饲养，定量喂食。Beagle犬实验前至少驯养1~2周;杂种狗应先检疫，驱虫。2020/1/14任立群43试验前观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、心电图，检测心、肝、肾功能2次；选择正常、健康、雌性无孕的动物作为受试动物。2020/1/14任立群44雪貂作为实验动物的资料介绍，还在本世纪，虽然它还未被广泛应用，但它对人类健康的贡献无疑是很重要的（北美常用）。2020/1/14任立群45雪貂是食肉类动物，属于鼬科。经驯化供实验的雪貂毛色呈野生色或白化的。它缺乏盲肠、汗腺，雄貂缺乏前列腺。通常雪貂的实验和繁殖期为5至6年，而整个寿命约14年。雄貂体重可为雌貂的两倍。雪貂在早期用于传播病毒性疾病的研究，如犬瘟和人类流感，对其它一些病毒性疫病，雪貂也提供了独特的、合适的模型，如麻疹、疱疹性口炎，阿留申病和牛鼻气管炎。雪貂已应用于病毒学、生殖生理、药理学等研究，最近报导特殊适合毒理学试验。还可作为小脑发育不全、流行性感冒等动物模型来研究人类相应的疾病。2020/1/14任立群46三、给药期限按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的3~4倍时间。创新药品试验周期应不少于90天，超过180天的新药可以在试验开始90天后，同时进行I期临床试验。创新药物是指具有自主知识产权专利的药物。相对于仿制药，创新药物强调化学结构新颖或新的治疗用途，在以前的研究文献或专利中，均未见报道。2020/1/14任立群47我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物﹤5天2周2周﹤2周1月1月2-4周3月3月1-3月6月6月﹥3月6月9月2020/1/14任立群48我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物﹤5天2周2周﹤2周1月1月2-4周3月3月1-3月6月6月﹥3月6月9月每天给药最好固定时间。2020/1/14任立群49四、剂量水平的选择三个剂量组是必不可少的：一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡率应控制在10%以内；一个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物有效剂量或临床治疗量的2~3倍)；为表明毒性作用的量—效关系，在上述两个剂量之间插入一个(或多个)中间剂量。2020/1/14任立群50亚慢性毒性试验基础最大剂量：选择90天试验中体重增长不到10%的剂量；中剂量：1/4最大剂量；低剂量：1/8最大剂量。2020/1/14任立群51最高剂量组的基本要求仅出现轻度毒性，不改变试验动物的正常寿命，或至少在给药的前四分之一时间内不影响动物的体质，外观无异常，可有血清酶活力的改变或轻度体重增长抑制（＜10%）。2020/1/14任立群52在选择合适的剂量时还应考虑到：①药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用；②药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。③药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法根据急性毒性的LD50值决定三个剂量。一般在大鼠3个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂量组可采用大鼠相应各组的1/2~1/3剂量。可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒性的量—效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动物等，先过渡到7天至21天的短期蓄积性试验，再将获得的参数外推于长期毒性试验。急性毒性试验蓄积毒性试验和/或7天短期重复给药试验90天重复给药试验180天或更长期重复给药试验2020/1/14任立群56可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法①Traina法第一步：确定大鼠亚急性毒性试验的最高剂量根据大鼠的急性毒性试验找出最大无症状剂量，再分别以该剂量及其1/3和1/10量给三组大鼠（雌雄各半）连续服药2~3周。（此剂量下的动物仅出现轻微的毒性反应，如食耗量略减，体重增