(生物学)动物病毒学实验技术

动物病毒学试验技术杨润德通过病毒学的学习，我们了解到病毒没有完整的酶系统，体内无核糖体等细胞器，因此不能在任何无生命的培养液中生长。所以要想增殖病毒必须在有生命的组织细胞内接种让其增殖，如：动物、鸡胚、细胞、器官。实验一、鸡胚接种发育中的鸡胚是病毒生长良好的环境，被广泛用于病毒（特别是禽病毒）的分离培养和疫苗生产等。病毒在鸡胚中的生长可以通过几种方法加以测定，如：采集尿囊液、羊水、绒尿膜、鸡胚作定量检定；采集以上样品作血凝滴定、血清学试验等；检查各部的病理学变化，如：鸡胚死亡、矮小、出血、羽毛发育不良、内脏坏死灶、绒尿膜水肿或增厚、坏死性痘斑、出血。除鸡胚外，根据病毒特点可以选用其他禽胚，如小鹅瘟病毒宜接种鹅胚，鸭瘟宜接种鸭胚等。影响病毒在鸡胚中生长的因素，包括鸡胚的日龄、接种途径、接种剂量、接种浓度、培养时间、培养温度。培养温度一般为35.5-37℃，有些病毒所需的温度更低。但很多哺乳动物病毒不适合在鸡胚中生长。1.选取SPF鸡群所产的蛋；2.受精卵在10℃左右保存不超过10d；3.最好选择白色卵壳的受精卵；4.卵壳无污染，孵化前在0.1%的新洁尔灭中浸泡约15min，最后用冷水冲洗，放卵架，或将卵放卵架用甲醛（1m2用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸时维持箱内温度为37℃20min后驱散甲醛蒸汽；5.孵化温度保持39-40℃，相对湿度60-65%，有风扇维持空气流通，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的质量和孵化根据不同病毒的嗜性，选择适宜的接种途径。最常用的途径有卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜3种途径，偶尔接种于羊膜腔、静脉、胚体等。在分离一种未知病毒时，最好3种途经均用，如果没有足够的受精卵，首选绒尿膜接种途径，因为大多数病毒都能适应。接种材料的处理：将组织置研钵磨碎，加5-10倍盐水并加入双抗混均，2000-3000r/min离心20-30min。取上清待用。二、接种途径卵黄是胚胎的营养物质，卵黄囊膜是由内胚层发育而来的，内层覆有一层绒毛。病毒可在绒毛细胞内生长，并且可以由此扩散到胚胎的其他部位。㈠卵黄囊1.取5-8日龄鸡胚，在照卵器上画出气室和胚胎的位置；2.直立于卵座上，于气室部碘酊消毒后打孔；3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黄吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出针头封口。放孵化器中继续孵化，每天照卵2-3次。接种方法尿囊是鸡胚的排泄器官。腔内充满排泄物尿囊液。液体的容量因卵的大小而异，一般6日龄鸡胚时约1ml，11日龄时约6ml，13日龄可高达10ml，以后逐渐减少直到消失。13日龄时的尿囊液是无色透明的，14日龄后逐渐变浑浊，呈乳白色，有时淡黄色。㈡尿囊腔接种1.取9-10日龄鸡胚，照卵，画出气室，离气室边缘0.3-0.5cm用铅笔作一记号；2.在气室做记号处用碘酊消毒，打孔；3.用注射器取毒液自接种孔斜刺入约1cm，注入毒液0.1-0.2ml；4.封孔继续孵化，定时照蛋。接种方法绒尿膜是鸡胚的呼吸器官，由尿囊膜和绒毛膜紧密粘合组成，无法分开。绒尿膜上有丰富的血管，照蛋时清晰可见。㈢绒尿膜接种方法一将待检液滴在气室膜上，透过卵膜扩散到绒尿膜上。原理是气室卵膜性脆，刺破后不再闭合，而绒尿膜是活组织，有韧性刺破后能立即闭合，接种液不能透过。接种方法1.取9-10日龄鸡胚，照卵器画出气室范围；2.将卵直立于卵架上，气室向上，于中央消毒打孔；3.以1ml注射器配以2.5cm5-6号针头，自小空刺入气室约0.5cm，滴加待检液0.1-0.2ml于气室内的卵膜上，将针头继续垂直刺入，拔出针头，封口，继续孵化定时翻蛋。可随意放置。方法二此法做人工气室，能保证毒液接种在绒尿膜上。1.取9-10日龄鸡胚，画出气室及胚胎位置中的无血管区；2.将卵横卧于卵架上，胚胎位置向上；3.在胚胎部位及气室部碘酊消毒，气室中央打孔，胚胎部位用钢锯划破卵壳但不破坏绒尿膜；4.用橡皮吸球吸气室部的空气，使卵内容物移向气室，促使破壳部位的绒尿膜下陷，形成人工气室；5.自人工气室接种待检物0.1-0.2ml；6.将卵壳移回原位或用灭菌玻璃纸封口用胶布固定；7.将卵放回孵卵箱继续孵育，人工气室向上，每日检卵2-3次。㈠检查鸡胚接种待检材料后孵化1-6d，此期间每天最少检卵2次。接种24h死亡胚一般视为非特异性死亡，弃去。以后死亡胚立即取出放置4℃内至少4h，以使血管收缩。冷藏时间不得超过24h，否则胚液蒸发，气室卵膜难于剥离，影响病毒的收获。三、鸡胚接种后的检查和收获㈡鸡胚内容物的收获1.尿囊液的收获⑴将卵直立于卵架上，气室向上；⑵气室部碘酊消毒，击破并除去卵壳；⑶用灭菌镊子撕去气室部的卵膜及绒尿膜，可见尿囊液澄清透明；⑷用吸管或注射器采集尿囊液，菌检弃去细菌污染的尿囊液。2、羊水的收获⑴1-4与尿囊液的收获一样；⑵吸取尿囊液后用镊子提起羊膜，用细吸管刺入羊膜腔吸取羊水。3、绒尿膜的收获⑴1-3与尿囊液收获相同；⑵用小剪刀剪取气室部的绒尿膜，观察病变并收获；⑶吸取尿囊液，将卵黄倒入平皿，剪断卵带收取绒尿膜低温保存。4.卵黄囊的收获⑴1-4与尿囊膜的收获同；⑵将卵内容物全部倒入平皿中；⑶用镊子夹住卵黄带，剪断，将卵黄囊提起，置于另一平皿内，刺破卵黄囊，用生理盐水洗去卵黄，将卵黄囊低温保存。实验二、细胞培养细胞非常娇嫩，在体外培养时生长液中不能含有任何对细胞有害的物质，而且与细胞接触的玻璃器皿应不含有任何对细胞有害的物质。目前市场上有灭菌的一次性使用的96孔、24孔、12孔板及细胞培养瓶。在研究病毒时要大量增殖病毒，一次性瓶太昂贵，因此要求使用玻璃器皿，但它要经过洗涤与消毒后方可使用，并可重复使用。1、玻璃器皿的清洗在组织培养中工作量最大的莫过于清洗玻璃器皿。清洗的玻璃器皿要求干净透明、无油渍，而且不能含有任何毒性物质，毒性物质包括解体的微生物、细胞残余物以及非营养性的化学物质，有些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用，因此新购置的以及使用过的器皿要进行严格的清洗。一、器材的洗涤与消毒⑴浸泡新购置的玻璃器皿其上带有干固的灰尘，同时生产的原因，使其常呈碱性并带有毒性物质如：铝和砷等，所以使用前用5%盐酸浸泡，以中和其中的碱便于清洗。用过的器皿往往有大量的蛋白质附着，用后立即清洗浸泡。⑵刷洗浸泡后的器皿于洗涤剂中用毛刷洗去玻璃上的杂质。⑶酸浸刷洗不掉的极微量的杂质，经过清洁液浸泡的强氧化作用被除掉。清洁剂对玻璃器皿无腐蚀作用。去污十分有效，是清洁过程中关键的一环。清洁液使用重鉻酸钾、浓硫酸、水按一定比例配制而成，浸泡时溶液要充满容器，不要留有空气。配制时，要将重鉻酸钾溶于水中，再缓慢加入硫酸，加硫酸时不要过急，因其产热过大，会有危险，清洁液呈棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变绿，失效。强次强弱重鉻酸钾63g120g100g硫酸1000ml200ml100ml水200ml1000ml1000ml⑷冲洗酸浸后用水充分冲洗用洗涤剂彻底清洗，不留任何残迹，至少每瓶用水灌满倒掉重负12次，再用蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗3-5次晾干备用。2、朔料器皿的清洗先用清水浸泡冲洗，用2%NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，再用5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗，蒸馏水冲洗3次晾干，用70-75%乙醇冲洗37℃晾干备用。3、胶塞的清洗用水浸泡，2%NaOH煮沸10-20min，自来水冲洗，再用1%盐酸浸泡30min，流水冲洗，蒸馏水漂洗，晾干备用。组织培养最重要的是防止微生物污染：其来源①组织已受污染；②操作时空气流动；③操作者的疏忽；④培养用具消毒不严。因此组织培养一定要严格消毒措施。消毒随物品的不同采用不同的方法：物理灭菌法化学灭菌法二、消毒1、紫外线：对空气、朔料器皿，消毒效果与距离密切相关，一般维持30min。2、干热灭菌法3、湿热灭菌法4、过滤除菌5、消毒剂，来苏、新洁尔灭、乙醇是最好的消毒剂。用来消毒桌、椅、天花板、地板，操作者的皮肤，乳酸对空气消毒十分有效。6、包装。其目的是防止再次污染。1、HanK’s液2、乳汉液3、0.4%酚红：酚红0.4g，0.1mol/LNaOH2.85ml，将酚红于乳钵中，加入NaOH研磨至全部溶解，加去离子水至100ml，装瓶灭菌备用。4、0.25%胰蛋白酶，用无钙镁离子的磷酸盐平衡盐水配制，并用NaHCO2将PH值调至7.8，过滤除菌分装备用。三、溶液的配制0.02%EDTA液，商品名为Versene，是一种螯合剂，与钙镁离子形成稳定的复合物，从而使组织细胞松散，常用于使细胞从玻面脱落。配制方法，EDTA0.2g加无钙镁磷酸盐平衡盐水1000ml，溶解后分装，高压灭菌备用。有时0.25%胰酶与0.02%EDTA等量混合，消化效果更好。5、199、1640、MEM、DMEM按说明书配制。6、犊牛血清，其含10多种氨基酸、激素、无机盐类及一些未知成分。不加血清的营养液，细胞不能贴壁，且生长不良。使用前56℃灭活30min，加入的量因细胞种类不同而异，5-10%。7、抗生素，①青、链霉素，配制成1万单位或1万µg/ml，使用时在营养液中加入1%。②庆大、卡那霉素，广谱抗菌素，抗霉形体且稳定，能耐高压灭菌，营养液浓度50-100µg/ml。③制霉菌素、两性霉素，配制成1000µg/ml-20℃保存，使用剂量为5-10µg/ml，视细胞耐受程度调节。应用胚胎或幼小动物的组织制备培养，因其分裂旺盛，易生长。各种动物的大多数组织都能在体外培养，最常用的有肾、睾丸、肺、皮肤等。本试验以鸡胚为例：1、取10-11日龄鸡胚，气室部消毒，用无菌镊击破蛋壳，除去卵壳、卵膜；2、将鸡胚移入无菌平皿中，用无菌剪、镊去头、脚、翅、内脏、眼睛，用Hank,s也洗2次，移入三角瓶中，剪成1-2mm2小块用Hank,s洗3次。四、原代细胞培养3、按3-5倍加入胰酶，于37℃作用30min，每10min摇一次，静置后弃去胰酶。洗2次加入含血清的营养液或乳汉液，吹打数次。4、用2层或4层纱布过滤于离心管中，800转/分离心10分钟，取沉淀。5、按1：200-250加入营养液分装培养瓶或96孔板，于37℃静置培养。五、传代细胞培养由于遗传突变或在理化学物质的作用下，组织细胞中有时出现恶性变细胞，即癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能，而且几乎可以无限传代。固称传代细胞系。其染色体已经发生改变，不再是二倍体细胞，故称异倍体细胞。有人体或动物体取得肿瘤组织进行培养，比较容易获得传代细胞系。传代细胞的传代，将长满单层的细胞用消化液洗3次，消化细胞并使其从瓶壁上脱落下来，敲打细胞培养瓶，使细胞分散，加入2-3倍的营养液，分装细胞培养瓶，静置培养。待长成单层待用。实验三、病毒的接种及检查不同病毒接种于细胞的时间不同①待细胞生长成单层后接种病毒；②细胞分装培养12h后接种病毒；③病毒与细胞同步接种培养。1、将病料制成1：10匀浆，加入双抗，3000转/分，离心30分钟或15000转/分离心5-10分钟，取上清待接种。2、取不同生长时期的细胞，弃去细胞培养液，按1：10接种病毒材料37℃吸附1/2-2h，使病毒吸附于细胞膜上。3、弃去病毒液，加入维持液，于37℃静置培养。4、逐日在显微镜下检查CPE，或进行其他试验。接种病毒2天后，如维持液混浊，说明有细菌污染，弃去。实验四、空斑形成技术1952年创立该试验方法，将10倍梯度稀释的病毒样本分别接种于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色感染病毒的细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落，称为空斑或蚀斑。空斑是细胞病变的一种特殊表现形式。一个空斑可能有一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可以获得只含有一个病毒颗粒及子代的空斑，这就是病毒克隆。1、测定病毒液中病毒的含量（PFU计）。2、可以用来测定某病毒的特异性抗体及抗体效价。如：新城疫病毒稀释10-6，每毫升病毒液含100个PFU，即稀释液0.1ml含10个PFU，取培养好的细胞5瓶分别接种0.1ml的病毒