HIV-1-P24抗原检测方法研究进展

HIV-1P24抗原检测方法研究进展关键词：HIV-1P24抗原；酶免疫测定法；检测方法今年是世界艾滋病流行以来的第33个年头,全球艾滋病流行与防治形势都发生了巨大的变化。自上世纪九十年代中期高效联合抗逆转录病毒治疗（highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART）技术应用以来,成千上万的艾滋病病人得到有效治疗。然而，由于HIV本身的高变异率，导致临床上尚无有效的根除HIV的治疗方法。因此，对艾滋病的防控手段仍以预防为主。目前，对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等。由于从感染HIV到出现可检测的抗体尚有一段时间，因此虽然抗-HIV检测的ELISA试剂经历了4代发展[1]，但其“窗口期”问题仍不可避免；而可以进一步缩短“窗口期”问题的核酸检测和CD4+T淋巴细胞水平检测，由于其检测过程较复杂、耗时较长且需要特殊仪器而不易普及。HIV-1侵入人体后，核心抗原P24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。因此，血液及其他体液标本中P24抗原的检测可以缩短窗口期，有助于HIV-1的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果，具有良好的实际应用价值。1P24抗原的生物学特性HIV属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径约100-120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成。核心包括两条单股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，包括逆转录酶（RT,P51/P66），整合酶（INT,P32）和蛋白酶（PI，P10）.核心外面为病毒衣壳蛋白（P24，P17）.病毒的最外层为包膜，其中嵌有gp120(外膜糖蛋白)和gp41(跨膜糖蛋白)两种糖蛋白。HIV基因全长约9.8kbp,含有3个结构基因（gag,pol和env）、2个调节基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节因子）和4个辅助基因（nef负调控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子）。HIV变异性很强，各基因的变异程度各不同。其中以env基因的变异率最高，gag和pol基因相对保守。Gag基因编码55kd的前体蛋白，在pol基因编码的蛋白酶的加工下产生P17、P24和P55蛋白，因此P24蛋白氨基酸顺序高度保守，这使其在HIV-1感染的检测中显示良好的规律性。2P24抗原的检测方法2.1ELISA检测P24抗原目前，商品化的P24抗原检测试剂盒都是依据夹心Elisa。首先以P24单克隆抗体包被微孔板，加人待检标本孵育，待检标本中若存在P24抗原，则被“捕捉”结合于包被抗体，然后依次加入生物素化的抗．HIV多克隆抗体、链亲合素化的辣根过氧化物酶和反应底物显色，最后用酶联免疫检测仪测定OD值判断结果。标准P24抗原检测方法的阳性检出率相对较低，在无症状携带者中通常仅为8％一10％，在艾滋病相关综合征(AIDS-relatedcomplex，ARC)患者中为12％，在AIDS患者中为37％一86％。这种低检出率可能与感染早期P24核心抗原量较少，以及在病情发展阶段P24抗原与抗体形成抗原抗体复合物阻碍了抗原的检测有关。改进标准的方法或设计新方法，可以增强检测的敏感性，提高阳性检出率。目前开发的第4代H1V诊断试剂就是在第3代试剂的基础上，加入了HIV-1P24抗原检测系统，可同时检测血清／血浆中的HIV-1抗体和P24抗原，使诊断窗口期与第3代ELISA检测试剂相比，平均缩短了4d，使艾滋病早期诊断的效果明显优于第3代。既便如此，第4代试剂仍然有2-3周的诊断窗口期。此外，由于抗原和抗体同时包被在反应板上，存在着相互干扰的可能，影响了免疫反应的特异性，再加之第2窗口期的存在，影响了检测的敏感性。因此通常来讲，使用第4代试剂检测P24抗原，其灵敏度[(20-l00)pg/m1]远远低于单独检测抗原抗体分析法[(3.5-10)pg/m1]。从方法学上来讲，这种基于ELISA的分析方法，灵敏度终归是有限的，相对化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等更为先进的分析方法，其灵敏度仍较低[2-5]。2.2P24抗原检测的新方法由于ELISA本身的局限性以及P24抗原检测在HIV-1诊断中的重要作用，近几年来国内外对建立高灵敏度检测P24抗原的研究一直就未曾停止过。先后研发了免疫复合物解离P24抗原测定法(immune-complexdisassociate，ICD)，信号放大增强ELISA(signal-amplification-boostedELISA)，超敏感酶免测定法(ultrasensitiveenzymeimmunoassay，UEI)，免疫吸附电镜法(immunosorbente1ectronmicroscopicalmethod，ISEM)和纳米粒子生物条形码检测技术(nanoparticle-basedbiobarcodeamplificationassay，BCA)等新方法。2.2.1ICD与信号放大增强ELISA近年来发展起来的ICD分析方法，是指用酸、碱或加热的方法使免疫复合物发生解离。常用的方法是用热处理将血清中免疫复合物解离后，再进行测定，从而提高检测血清中P24抗原的敏感性和阳性检出率。SchUpbach[6]等分别用热处理和酸化的方法解离免疫复合物后用ELISA检测，发现其阳性率由26.5％分别提高到67.8％和53.1％。信号放大增强ELISA是利用生物素标记的Tyramide扩增信号，然后使用偶合有荧光素的亲和素进行检测，它是基于TSA信号放大系统的ELISA检测方法，其灵敏度远远高于普通ELISA。2003年，Sutthent等[7]将免疫复合物热解离后通过TSA信号放大系统的ELISA使P24抗原检测的最小检出值由原来的10ps/ml降至0．5pg/l，在HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当，与HIV核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。2006年，Nouhin等[8]对167份血液样本进行分析后发现，普通ELISA和增强ELISA的最小检出值分别为10pg/ml和2pg/ml，将核酸检测、增强ELISAP24抗原检测和病毒培养等方法进行分析后发现其特异性均为100％；其敏感性则依次为：100％(pol-DNA-PCR)，93．5％(gag-DNA-PCR)，91.3％(增强ELISAP24检测)和91.1％(病毒培养)。这些研究结果表明ICD及信号放大增强ELISA检测P24抗原的方法，与核酸检测和病毒培养具有相近的灵敏度和特异性，但由于其操作更简单、耗时更少、成本更低而具有更为广阔的应用前景。2.2.2UEIUEI又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定法，其基本原理是利用高亲和力抗体浓缩富集P24抗原，然后进行检测。其技术路线是：将待检样本中的抗原同时与2，4-二硝基苯酚-生物素-牛血清白蛋白-抗重组P24抗体Fab，复合物及另1种抗重组P24抗体Fab，-β-D-半乳糖苷酶复合物反应，形成抗原与这两种复合物的复合物，用包被有抗-2，4-二硝基苯酚的有色聚苯乙烯珠吸附这种复合物，洗涤去除多余的β-D-半乳糖苷酶；然后用过量的2，4-二硝基苯酚．赖氨酸复合物竞争性地使抗原复合物解离下来，转移结合到链亲和素包被的白色聚苯乙烯珠上，通过洗涤更加完全地除去非特异性结合的β-D-半乳糖苷酶，最后加入底物，并以荧光检测仪分析白色聚苯乙烯珠上的β-D-半乳糖苷酶活性[9]。Hashida等[10]通过优化反应条件大大缩短了检测时间，将整个免疫反应时问(包括复合物的形成、吸附及转移)缩短为l5—30min，并可检测出P24抗原浓度仅为0．24pg/ml的血清样本中的抗原，样本用量仅需l0μL；并且与HIV抗体的ELISA检测相比，可提前12—20d检测到P24抗原。该法灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低廉，有望在发展中国家成为替代HIVRNA检测的1种重要方法。2.2.3ISEMISEM是将抗原抗体的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，对病毒颗粒直接特异性检测的1种方法。该方法与胶体金免疫标记结合起来的技术，可用于检测HIV-1的可溶性P24抗原，并可检测多种体液样本(如血液、精液、唾液及脑脊液)中的P24抗原。但该法仍处于早期研究阶段，其对血液中P24抗原检测的敏感性比EIA法稍低，但其它体液中的敏感性则比EIA法更高。但因其需要昂贵的仪器，且操作复杂，距临床实际应用尚有一段距离。2.2.4BCA基于纳米技术的生物条形码检测技术是根据免疫学原理，应用特异性抗-P24单克隆抗体，特异性结合样本中的P24蛋白抗原，通过生物条形码DNA准确而特异地放大，间接定量检测HIV-1P24抗原[11]。其技术路线为：第一步，先用抗-P24抗原的单抗功能化的磁性微珠MMPS(magneticmicroparticle)特异性结合样本中可能存在的P24抗原，加上磁场固定MMPS，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的抗原和不相关的蛋白；第二步，加人被双链DNA和抗-P24的多抗修饰的金纳米微球NP(Aunanoparticle)探针，将P24抗原夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，在用磁铁固定化MMPS的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第3步，是1个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，则NP探针上结合的数以百计的条形码DNA被释放在溶液中，接着对条形码DNA进行定量，从而对微量目标蛋白信号进行了放大。这一过程类似于聚合酶链式反应(PCR)中DNA聚合酶的使用。生物条形码检测的关键是通过形成三明治结构将特异抗原均一得分离。灵敏度提高的关键在于目标抗原的有效回收和作为每个抗原识别结合位点对应的条形码DNA链释放的结果的放大过程。条形码DNA的量对应了微量目标蛋白的量，因此我们可以通过定量条形码DNA间接定量微量蛋白。通过这种方法和适当的抗体，可以程式化地在像血浆这样的复杂样本中检测到低至30个拷贝的目标蛋白。Kim等[12]应用BCA检测112份HIV-1感染血浆样本中的P24抗原，发现BCA可检测各个亚型HIV-1的P24抗原，特异性100％，敏感性99％，远远高于普通ELISA法检测P24抗原的敏感性(34/112)。Tang等[11]应用改进的BCA进行研究发现(用抗-P24包被微孔板捕获样本中的P24抗原，用链亲和素包被的纳米粒子生物条形码DNA扩增信号，然后用芯片扫描进行检测)，这种方法较普通ELISA敏感150倍，45例HIV-1RNA阳性血浆的BCA检出率为100％，且可比普通ELISA法提前3d检出P24抗原。BCA法不失为一种早期检出P24的较为敏感的方法。3P24抗原检测的临床应用及发展前景目前许多国家均采用测定病毒RNA的方法来缩短检测窗口期，病毒RNA的检测窗口期短，且在HIV感染的各阶段均存在，因此这种方法也常被应用于监测病程进展和判断抗病毒治疗效果。RNA测定法较P24检测法成熟、灵敏度高，但因其操作复杂、耗时长、花费高，且需要特殊昂贵的仪器，因此，在许多发展中国家中难以推广应用，有碍疾病的治疗和控制。2004年，HIV病毒发现者之一、美国马里兰大学Dr．Gallo[13]领导的实验室的1篇高灵敏度检测P24抗原的研究论文引起了广泛的关注：P24抗原检测方法的灵敏度得到了大幅提高。随着其检测灵敏度的不断提高，P24抗原的检测逐渐从主要用于在窗口期辅助早期诊断和进一步缩短窗口期，发展到用于病毒载量的测定。目前，P24抗原在以下几方面都有重要应用：抗-HIV-1不确定或“窗12期”的辅助诊断；抗-HIV-1阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第4代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但抗-HIV-1确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。随着P24抗原检测技术的不断进步，低成本的P24抗原检测有望在一定程度上替代现有的昂贵的RNA测定法。参考文献[1]LyT.D.,LapercheS.,Brenna