生物催化剂的修饰与改造

1第八章生物催化剂的修饰与改造2酶蛋白分子水平的改造基于序列的合理化设计（sequentialrationaldesign）,如化学修饰、定点突变（site-directedmutagenesis）非合理设计（irrationaldesign），利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程。如定向进化（directedevolution）杂合进化（hybridevolution）3酶分子的研究：认识、改造和应用认识酶:利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间的关系，以及氨基酸残基功能的信息。改造酶：（1）合理设计：以酶分子结构特征为根据，对酶分子进行改造。（2）非合理设计：不需要准确的酶分子结构信息，而通过随即突变、基因重组、定向筛选等对酶进行改造。4生物催化剂的化学修饰酶分子修饰：酶蛋白分子的结构发生改变----改变酶的某些特性和功能。广义的说：蛋白质的修饰，通过化学基团的引入或除去—改变蛋白质的共价结构。酶分子的完整空间结构两面性：赋予酶的生物催化功能和特性，导致酶的稳定性差、活性不高。5酶分子的修饰目的人为的改变天然酶的某些性质：创造天然酶所不具备的某些优良特性，扩大酶的应用范围。1）提高生物活性、2）增强在不良环境中的稳定性，3）新的催化能力。4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响如：脂肪酶和蛋白酶被MPEG修饰后，可溶于有机溶剂，催化酯合成、酯交换、肽合成。如：a-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，抗不可逆热失活的稳定性在60C可提高1000倍。如：对脂肪酶的CRL的非特异性化学修饰，大幅度提高立体选择性。6什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。7酶蛋白修饰的方法大分子结合修饰小分子修饰物理修饰化学修饰8大分子修饰剂的化学修饰（共价和非共价）非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。9用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰10小分子修饰剂的化学修饰小分子化合物对活性部位或活性部位之外的侧链基团化学修饰。方法：酶分子的表面化学修饰、内部修饰、酶分子非催化活性基团修饰、酶分子催化活性基团的修饰、酶蛋白的主链修饰、辅因子相关的修饰。11酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。12酶蛋白修饰的方法物理修饰化学修饰主链修饰侧链基团修饰金属离子置换修饰组成单位置换修饰定点突变1314通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。酶分子的物理修饰15酶蛋白的固定化方法修饰固定化可通过空间障碍、分配或扩散限制等效应影响酶的稳定性。空间障碍使得其他大分子难于与酶作用，载体上的酶能抵抗蛋白水解酶的降解，固定化后也能抑制某些化学失活。固定化后，微环境和游离酶有所改变，影响最始pH、底物专一性和动力学常数。如阳离子resin载体，最适pH升高；阴离子resin载体的固定化，最适pH偏低。如：凝胶包埋，外部与内部传质都存在扩散效应，可以明显使酶更加稳定。如：a-胰凝乳蛋白酶包埋在PAA和PAGE凝胶中，60C时，提高1000倍。16酶蛋白的反胶束修饰提供包埋酶的口袋，使酶微胶囊化，保护酶，使其在不利环境下有效发挥作用。提高酶活，改变专一性。如：游离脂肪酶在油脂甲醇解反应体系，反胶束体系，活力、稳定性提高5倍。17酶蛋白化学修饰的方法主链修饰侧链基团修饰金属离子置换修饰组成单位置换修饰定点突变18主链的修饰：生物大分子酶，组成单位主要是氨基酸和核苷酸。AA通过肽键连接成肽链，在通过盘绕折叠形成完成的空间结构。蛋白类酶的主链-肽链，是酶分子结构的基础。主链一旦改变，酶的结构和特性将随之发生改变。主链的切断和连接-主链修饰：切断-酶原的活化，连接-1个酶分子上具有两种或多种催化活性的多酶融合体。19酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水修饰。有些生物体可以生物合成不显示酶催化活性的酶原,利用具有高度专一性的蛋白酶对其进行肽链有限水解修饰,显示出酶的催化活性或提高酶活力。20•胃蛋白酶原的激活HCl胃蛋白酶原pH1.5～2（从N端失去44个氨基酸残基）自身激活胃蛋白酶2122侧链的修饰：酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。羧基、氨基、精氨酸胍基、巯基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、酪氨酸残基脂肪羟基、甲硫氨酸甲硫基23侧链基团修饰基团的修饰可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp24分子内交联修饰含有双功能基团的化合物（双功能试剂）在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，根据其功能基团的特点分为：同型双功能基团化合物异型双功能基团化合物。25酶的金属离子置换修饰概念：酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，酶的特性和功能发生改变。若从酶分子中除去其所含的金属离子，丧失催化活性，重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的使酶活力提高或者增加酶的稳定性。该法只适于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。一般都是二价金属离子。26酶的组成单位置换修饰酶分子的基本组成单位：氨基酸、核苷酸，是酶的化学结构和空间结构的基础，微小的改变引起酶的特性和功能。修饰方法：氨基酸置换修饰:酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸。核苷酸置换修饰：酶RNA的基本组成核苷酸，核苷酸链上上某一个核苷酸换成另一个核苷酸。27核苷酸定位突变技术置换修饰例：L-19IVS活性中心上碱基的改变引起其底物专一性的变化L-19IVS22～27位的核苷酸序列底物IⅡ催化产物5’-GGAGGG-3’GGCCUCUAAAAA(1)GGGCCUGUAAAAA(2)GGGCCGCUAAAAA(3)GGGCCUCU+GAAAAA无反应无反应5’-GCAGGG-3’(1)G(2)G(3)G无反应GGCCUGU+GAAAAA无反应5’-GGCGGG-3’(1)G(2)G(3)G无反应无反应GGCCGCU+GAAAAA28定位突变技术用于酶分子修饰定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。1、基因序列分析,2、蛋白质结构分析,3、酶活性中心分析,4、引物设计进行基因定点突变,5、酶基因克隆表达,6、变异特性分析定点突变技术应用于酶分子修饰:在DNA水平改变已有蛋白质的编码序列的基本方法，在已知的DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变酶结构中的个别AA残基。--理性分子设计①新的酶分子结构的设计，②突变基因碱基序列的确定，③突变基因的获得，④新酶的获得29定点突变的局限基于酶蛋白的空间结构蛋白质结构与功能间关系的复杂性：蛋白质序列决定高级结构、高级结构影响酶特性，如：蛋白质序列影响蛋白质的异源表达、高级结构的催化活力受非天然环境的影响等。成功率低30生物催化剂的定向进化dierectedevolution非理性设计irrationaldesign,不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的计划条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组、自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（筛选）出所需要的性能优良的酶。酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构造一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。31定向进化原理：对单一酶分子基因进行定向进化为例，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’-5’校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合。选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正定向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择（或筛选）方法，选出所需要性质的优化酶，从而排除其他突变体。32定向进化的一般过程：（1）基因的选择：选择编码所需蛋白质的DNA序列。（2）突变或重组：通过易错PCR引入随即突变或DNAShuffling等方法增加基因序列的多样性。（3）突变基因文库的构建：将获得的突变重组基因插入到表达载体中的构建突变库。（4）突变体酶的表达：将载体转入受体细胞表达变异酶。（5）目的酶的鉴定：利用筛选和选择方法确定有益的特性克隆。（6）分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的蛋白质。33定向进化策略ErrorpronePCR易错PCRDNAshufflingDNA改组exonshuffling外显子改组Hybridenzyme杂合酶Random-prominginvitrorecombinationPCR体外随机引发重组Staggerextensionprocessstep交错延伸Random-site-directedmutagenesisinvitro随机定向突变34易错PCR技术为代表的无性进化无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。主要的手段包括易错PCR，盒式诱变，随机/定位诱变等。易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如：提高Mg2+离子浓度，加入Mn2+离子，改变体系中四种dNTP的浓度等，然后选择或筛选需要的突变体。其中关键之处在于突变率需要仔细调控。35连续易错PCR：经过一次突变的基因