(03)金属螯和层析

1金属螯和层析操作规程一、溶液配制1、8×Binding溶液40mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.92、4×Elute溶液4M咪唑2MNaCl80mMTris-HClPh7.93、8×Wash溶液160mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.95、4×strip溶液40mMEDTA2MNaCl80mMTris-HClPh7.9注：（1）如样品在变性状态下，则应在Binding，Elute，Wash溶液中加入4~8M的尿素。（2）PH的调节应在加完尿素和稀释完储液后调节。二、层析过程21、装柱将适当体积的柱料装入层析柱，用超纯水以工作流速的压实柱料（至少三个柱体积），以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。注：以下的层析操作流速不要超过装柱流速的1.75倍。2、柱平衡由层析系统依次五个柱体积的Charge溶液和三个柱体积的Binging溶液。注：柱子挂上镍离子后，可在Binging溶液中过夜，4℃。3、上样视样品的多少可选用LOOP或由泵直接上样两种方式，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。4、淋洗十个柱体积的BINDING溶液洗过后，用六个柱体积的WASH溶液淋洗，以去除非特异结合的蛋白质，接穿透峰以备SDS-PAGE检测。5、洗脱对于未知的蛋白初提液，可采用10mM~500mM的梯度洗脱，并使用SDS-PAGE检测活性峰。6、柱再生用六个柱体积的STRIP溶液洗去镍离子。7、柱保存用水，20%的乙醇依次过柱，置于4℃保存。注意：（1）层析具体操作中各缓冲溶液的注入量以PH及电导基线基本不再变化为止。（2）所有的样品和溶液层析前，应脱气和过膜（0.45μm）。（3）当柱流速明显减低或层析介质被charge后不再变蓝时，需再生柱子。再生的方法：依次将以下的溶液按建议的体积数处理介质。两个柱体积的8Ｍ的尿素，两个柱体积的水，一个柱体积的２％ＳＤＳ，一个柱体积25%的乙醇，一个柱体积50%的乙醇，一个柱体积75%乙醇，一个柱体积3100%乙醇，一个柱体积75%乙醇，一个柱体积50%乙醇，一个柱体积25%乙醇，一个柱体积水，五个柱体积100mM的ＥＤＴＡ(PH=8.0)，三个柱体积水，三个柱体积20%的乙醇，储存于4℃。（4）加变性剂的Binding溶液应在平衡的最后步骤中使用，故应配两组Binding溶液，即8×且不含尿素和1×含尿素。（5）ＤＴＴ，ＢＭＥ，ＥＤＴＡ应避免在层析溶液中，因为ＤＴＴ，ＢＭＥ会与镍离子形成棕色沉淀，而ＥＤＴＡ会剥离镍离子。（6）为减少样品的粘度，可用Ｄnase处理（不用超声时），方法如下：在样品液中加入终浓度为10mMMgSO4，20μg／mlDnase室温放置20分。但此种处理方法会增加样品被蛋白酶水解的危险。（7）加入蛋白酶抑制0.2Ｍ的乙醇溶液，－20℃储藏。工作浓度为储液稀释200倍。（ＰＭＳＦ在水溶液中的半衰期短）。（8）Ｗash溶液的咪唑需调节，与组氨酸的长度有关。如六个组氨酸所需的淋洗浓度低于十个组氨酸所需的淋洗浓度。（9）变性蛋白质的一般复性方法。Ａ、透析既逐步降低变性剂的浓度；Ｂ、稀释法（10）可将变性剂直接加入到Binding，Washing,Elute溶液中，但需在加入变性剂后调节PH至所需的值。