09第九讲蛋白质的化学修饰与克隆(二).

第九讲蛋白质的修饰与克隆表达（二）第一节蛋白质的化学修饰第二节蛋白质的分子生物学改造第三节蛋白质(基因)的克隆（与）表达蛋白质化学修饰——复习•蛋白质化学修饰的目的和意义？•蛋白质化学修饰的主要部位是什么？•什么是位点专一性修饰？•亲和标记及其分类，与竞争性可逆作用的主要区别是什么？•肽链中出现切开，蛋白质三维结构和生物活性还能保持吗？若变性和复性会发生什么现象，这一现象有何意义。•提高蛋白质药物体内稳定性的策略。化学修饰？如何修饰？举例说明第二节蛋白质的分子生物学改造•基因突变技术•基因融合技术•为什么要进行蛋白质改造？–理论上，针对蛋白一级结构—高级结构—生物功能关系问题–应用上，针对蛋白质生物进化的适应性和生物活性的问题。•工业用酶：体外稳定性差，易失活。高温、高压、有机溶剂环境活性低、易失活•医用：抗原性、过敏反应、体内半衰期短等等–因此，需要对蛋白进行改造，在理论上和实践上具有重要意义。•为什么要利用分子生物学改造–化学合成，尤其是批量人工合成蛋白，造价高成本大，很难满足研究和生产需要。–生物体蛋白质合成的中心法则：基因→转录→翻译→蛋白质–20th70S以来，PCR技术和DNA重组技术建立和发展，基因工程广泛应用，以及基因突变等基因改造技术的发展；（关键技术）–分子生物学技术，已经成为蛋白质改造的有力工具，并形成一整套的技术，具有其独特的优势。(基因的克隆、筛选、表达)•优势：通过改变遗传密码。在一级结构上，能够随心所欲地改造蛋白质。–在实践上已充分证实，并有许多成功的实例和借鉴，方法简便、易行。–DNA合成的造价远远低于蛋白质的合成，当代，基因的合成已不是问题。•蛋白质分子生物学改造的策略——经验热稳定提高，有助于耐有机溶剂、极端pH•分子中引入适当的二硫键，显著提高稳定性•在高温下，蛋白质Gln、Asn脱氨，影响生物功能，替换成其他合适的氨基酸。原核生物表达真核基因，重组蛋白表达高，但活力低——替换重组多肽中多余的Cys，降低错误折叠的可能性，提高表达产物的生物活性。提高酶催化活性•根据酶活性中心结构参数和催化反应机理，替换个别氨基酸残基，随机改造肽段，或删除末端氨基酸序列等。•消除酶被抑制特性序列，强化配体—受体的亲和性，改善酶的催化特性。异源蛋白质药物，导致过敏——构建（人—鼠）嵌合基因，表达嵌合抗体，减少药物的抗原性。蛋白质基因改造方法：采用现代分子生物学技术——主要包括3种基因突变、基因融合、掺入非天然氨基酸等。以下简单介绍这三种技术，本节要求掌握前2种技术一、基因突变技术1、什么是？–在基因水平上对其编码蛋白质分子的基因进行改造，–通过其表达产物，来研究蛋白质结构和功能，–或得到优良蛋白质分子菌种的分子生物学技术。2、技术先进性–可称为：蛋白质结构—功能关系研究的革命性变化；–随心所欲、方便地研究特定氨基酸残基、特定结构单元，在蛋白质结构形成和功能表达中的作用；–创造新型具有优良特性的蛋白质分子，满足应用的需要。3、类型（2种）–定点突变和定向进化3、基因突变的分类基因突变定点突变（位点特异性）定向进化（随机突变）理性化设计非理性化设计3.1定点突变（sitedirectedmutagenesis）如何理解？在基因水平上，将DNA序列（基因）中某一特定位点碱基进行改变的分子操作技术。进一步理解取代、插入或删除——已知DNA序列中——特定的核苷酸，表达蛋白质结构中个别aa残基变化的——分子操作技术。理性分子设计？定点诱变技术用来对蛋白质（酶）分子重新设计并改造其物理化学性能，同时可以进行酶分子的构象-功能相互关系的研究。在已知蛋白结构和功能基础上，有目的、有计划地设计和改变蛋白分子中某一活性基团和模块，从而产生新性状分子。因此称理性分子设计。特点：与物理、化学等自然因素诱变方法相比突变位点清楚、突变率高、简单易行、重复性好（1）定点突变的方案设计（一）定点突变设计和选择——突变aa或突变的bpDNA模板的制备——目的基因寡核苷酸突变位点的引物的设计和选择突变碱基的导入目的基因——PCR反应等方法反应条件选择和优化DNA聚合酶的选择dUTP对基因合成反应的影响目的基因表达突变体的筛选及影响因素突变蛋白分离、纯化、功能测定简单介绍4种基本方法理解突变方案的设计Kunkel突变法基于抗生素抗性“回复”突变的方法基于去除特定限制酶切位点的突变方法基于聚合酶链式反应（PCR）的突变方法（2）定点突变的方法——简单介绍4种Kunkel突变法（试剂盒）制备U单链设计思路？制备目的基因模板导入突变碱基合成突变基因筛选突变基因PCRM13噬菌体设计思路Note：•E.Coli菌株缺陷型(dut-ung-)•dut-：dUTP酶•ung-：尿嘧啶-N-糖基化酶问题：缺陷型？野生型？噬菌斑？关键步骤——制备含U目的基因单链DNA模板基于抗生素抗性“回复”的突变方法制备和筛选目的基因Promega公司突变试剂盒序列突变筛选-氨苄抗性筛选耦连pALTER-1诱变载体基于去除特定限制性酶切位点的突变突变载体有克隆外源基因的克隆位点；具有独特的限制酶切位点；目标基因不存在该酶切位点。Why？两个引物:•引物1:突变引物;•引物2:去除独特酶切位点利用聚合物酶链式反应(PCR)产生定点突变重叠延伸PCR——DNA片段的拼接过程三种方式产生突变取代突变插入突变缺失突变PCR——？重叠延伸PCR——拼接DNA片段引入突变位点？？取代突变——利用双侧重叠延伸PCR*四条引物：a、b、c、d**b、c引物序列相重叠并含有突变碱基混合、变性、退火、重叠延伸插入突变——利用双侧重叠延伸PCR产生引物b和c，5’端含有插入突变的序列和重叠序列缺失突变——利用双侧重叠延伸PCR产生设计的缺失突变引物的互补区是否与DNA的互补区结合？对缺失突变的筛选有何影响？定点突变小结：•定点突变•定点突变的基因的筛选方法–Kunkel突变法–基于抗生素抗性“回复”突变的方法–基于去除特定限制酶切位点的突变方法–聚合酶链式反应（PCR）产生定点突变的方法•定点突变一般的方案设计3.2定向进化（1）定向进化技术——在体外（试管中）模拟体内突变、重组和选择等自然进化过程，使蛋白质的进化朝着人们需要的方向发展的技术。于20世纪90年代初，美国工程院院士，加州理工学院化工系教授，FrancesArnold，在达尔文自然进化理论的启迪下提出的。定向进化的实质——是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。自然进化和定向进化—两者的不同自然进化定向进化进化动力保守突变非保守取代进化速度非常漫长只需几年、甚至几天进化目标适应环境超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可能性。（2）定向进化思路•从一个目标基因或一群相关的家族基因起始，通过体外引入突变和/或重组的方法，创建分子的多样性。•利用特定的选择或筛选的方法，从突变多样性基因文库中，筛选出功能产物的基因。•进入下一轮进化，重复这个过程直到达到预定的目标。•也就是说，定向进化的宗旨是“得到你想要的”突变基因和突变体（3）定向进化技术——基本工具和方法A突变文库构建方法非重组型PCR——无性PCR易错PCR重组型PCR——有性PCRDNA改组随机引导重组交错延伸重组（略）注：不同的体外重组技术适合于不同的研究对象，在实际应用中针对具体问题选择合适的方法或方法组合。A1易错PCR（error-pronePCR)？：目的片段扩增的同时，引入碱基错配，导致目的基因随机突变。1985年，Leung建立，1992年Cladwell&Joyce完善原理:降低传统PCR中一种或者两种dNTP的浓度，加入一定量Mn2+，提高Mg2+浓度，采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时随机创造突变。突变只发生在单一分子内部,故称谓无性进化野生型基因突变的新基因特殊的PCR易错PCR技术要求：Why？适量突变频率，利于筛选和分析例如：300氨基酸残基的蛋白，可产生5700个突变子每个基因核苷酸的突变频率：1-2bp蛋白质氨基酸的变化频率：1AA举例——Chen（陈克勤）使用易错PCR策略枯草芽孢杆菌蛋白酶非水相催化（二甲基甲酞胺）PC3突变体催化效率提高256倍（60%溶剂）和131倍（85%溶剂）第二轮突变，突变体M13，催化效率提高471倍(60%)易错PCR技术特点操作关键：选择适当的突变频率优点：快速、简便、操作方便缺点：优化条件和筛选，比较费力耗时，一般适用于较小的基因片段(800bp)A2DNA改组（DNAShuffling)以DNA片段重组的方法，将存在于许多突变体中有益突变快速积累，删除个体中有害突变和中性突变的分子操作技术。也称体外重组技术，或有性PCR(sexualPCR)，在基因分子水平上进行有性重组，获得最佳突变组合的分子操作技术。1994，Stemmer等首次提出DNA改组的特点单一基因操作技术的延伸－基因家族改组(DNAfamilyshuffling):目的基因由单一基因发展为相关基因家族或一组有利突变体基因。要求基因家族有一定程度上的同源性。基因家族改组可提高基因突变频率．优点：单一突变或较大DNA片段突变基因突变频率高缺点：较高突变频率，会严重阻碍正突变组合的发现。A3随机引导重组(RPR)——略•1998年,Arnold在DNA改组基础上提出的一种有效的体外重组方法。•原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。•主要优点：1)合成的随机引物长度一致，保证了点突变和交换在全长后代基因中的随机性。2)随机引导的DNA合成不受DNA模板长度的影响。B选择和筛选策略•筛选：–在一个突变文库（集合）所有成员中，确认一个目标成员的过程。–在一个突变文库中，有意义的突变，经常埋没在众多的中性突变或不利突变群中。–如何筛选，建立适合的方法，在定向进化中非常重要的。–针对不同的突变文库，建立不同的筛选方法是必要的。•筛选的策略–具有问题、具体分析、建立特定的筛选方法。–首先建立正向筛选的方法—初筛（删除中性和不利）–其次建立最佳突变筛选的方法—复筛–与出发蛋白进行比对验证，进入第二轮突变和筛选•选择的要求–文库很大、筛选方法要求：高灵敏性、高通量•正向突变株和基因的筛选——初筛–在一个文库中，仅目标成员表现出来的特性，不符合要求的个体无法生长。–如：具有特殊酶基因的微生物才能生长，没有酶基因的个体无法存活。–如：高温——选择嗜热微生物克隆，不耐热的不能生长。•最佳突变株和基因的筛选——复筛–在特定的选择系统，微生物细胞的基因突变是极其多样的。–如：如何从正向突变中，选择最佳突变体，–还要建立一个合适的筛选系统，–建立和筛选过程——极其复杂和繁琐。•控制筛选规模(突变频率)的重要性–筛选过程是极其复杂和繁琐的–在定向进化中——突变体具有随机性，——通过特定方向的突变体的筛选，限定了进化趋势。–为了减少工作量，便于操作和筛选，–加快蛋白在某一方向的进化速度，–要控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库容量。•筛选的方法:高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立.–介绍几种筛选的方法突变体筛选方法——简介琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。流式细胞计数法细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。筛查含有目的基因的细胞克隆如：原位杂交流动池－核心工作原理流式细胞计数仪、分选仪工作原理示意图微孔板法——酶活性检测通过酶促反应的特征设计合成显色底物荧光共振能量转移同位素标记底物检测底物消耗量或产物生成量-0.0100.010.020.030.040.05010203040