1,SDYY12125079-王燕-10-羟基喜树碱对CIA的免疫调节作用(编辑审改稿)

10-羟基喜树碱对CIA的免疫调节作用王燕1(1郑州大学第五附属医院风湿免疫科450052)黄贺梅2(2郑州铁路职业技术学院医学技术系450052)胡晓舟1(1郑州大学第五附属医院风湿免疫科450052)胡慧华1(1郑州大学第五附属医院风湿免疫科450052)王燕女，汉族，陕西西安，1963年出生；1987年毕业于南京东南大学医疗系，学士学位；主任医师，硕士生导师。Email:[e-mail]。主要从事的专业：风湿免疫病；手机号[phone]。通信地址:河南郑州大学第五附属医院风湿免疫科。通讯作者:胡慧华,主任医师，Email:[e-mail]尊敬的编辑部负责同志：《10-羟基喜树碱对类风湿关节炎患者T淋巴细胞抑制作用研究》获得2011年河南省科技厅计划项目基金10万元，为河南省重点科技攻关项目。属于省部级立项课题论文。项目编号112102310610项目第一负责人：王燕[摘要]目的探讨10-羟基喜树碱对小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的免疫调节作用。方法通过10-羟基喜树碱干预CIA模型，观察小鼠发病情况，运用免疫组化技术观察局部关节病变程度；流式细胞术（FACs）分析T细胞亚群变化；酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞培养上清中转化生长因子（TGF-β）、γ-干扰素（IFN-γ）、白介素-17（IL-17）水平,检测调节性T细胞（Treg）、Th1、Th17细胞相关转录因子表达水平。结果经过10-羟基喜树碱干预，小鼠自身反应性T细胞的增殖能力被显著抑制。与CIA组比较，10-羟基喜树碱组Treg细胞百分比上升，Th1、Th17细胞百分比明显降低；各细胞分泌细胞因子的能力也发生相应的变化，其中TGF-β上升，IFN-γ、IL-17降低；Treg细胞转录因子Foxp3基因水平提高。结论10-羟基喜树碱可通过抑制CIA小鼠自身反应性T细胞增殖，上调小鼠体内Treg细胞并抑制Th1、Th17细胞的表达而发挥免疫调节作用，有效降低小鼠发病严重度和关节炎症。[关键词]10-羟基喜树碱；CIA；Treg；Th1；Th17ImmunoregulatoryrolesofHCPTincollageninducedarthritisWANGYan,HUXiao-zhou,HUHui-hua.TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,DivisionofRheumatology.450052,China.HUANGHe-mei.ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollegeofMedicalTechnology.450052,China.Correspondingauthor:HUHuihua,Email:[e-mail][Abstract]ThestudyaimstoexploretheimmunoregulatoryrolesofHCPToncollagen-inducedarthritis.DBA/1miceweretreatedwithHCPT,andthenusedtoestablishcollageninducedarthritis(CIA).Afterdiseaseonset,theincidence,severity,andjointhistopathologywereevaluated.WedetectedthepercentageofThsubsetssuchasTreg,Th1andTh17.ELISAassaywasusedtodetectthelevelsofrelatedcytokinesintheculturesupernatants.MiceintheHCPT-treatedgroupshowedalleviateddiseasesymptoms,andlessinfiltrationofinflammatorycellsinthejointsections.TheproliferationofCII-specificcellswasinhibitedintheHCPTtreatmentgroup.HCPTtreatmentalsoincreasedthepercentageofTregcells,butdecreasedthepercentageofTh1andTh17.TheresultsofthisstudyindicatedthatHCPTtreatmentcanreducetheincidenceandseverityofCIAbyup-regulatingTreganddown-regulatingTh1andTh17.[Keywords]HCPT;CIA;Treg;Th1;Th17类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以对称性多关节炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。持续的滑膜炎可导致关节内软骨和骨的破坏，导致关节功能受限。目前虽然针对RA的治疗方法较多，如采用免疫抑制剂、激素、细胞因子拮抗剂、阻断T-B细胞接触的信号途径等[1-3]，但疗效并不理想，且副作用大，如部分患者出现肝肾毒性或骨髓抑制等。因此，寻找疗效好、副作用少的新型治疗药物一直是类风湿关节炎治疗领域的热门话题。10-羟基喜树碱（HCPT）具有较强的抗肿瘤作用，从抑制细胞增殖的角度分析，该药物可以通过抑制淋巴细胞活性，进而抑制机体的异常免疫反应，因此，该药物从理论上能够起到控制RA疾病发展的作用。本研究采用CIA动物模型对HCPT的免疫调节作用进行了初步探讨。为了研究HCPT在CIA发病中的免疫调节机制，我们观察了HCPT干预后，CIA小鼠关节发病情况、自身反应性T细胞的增殖能力、以及发病不同时期T细胞亚群及相关因子的表达水平，为今后HCPT应用于RA的预防治疗提供更多的理论及实验依据。1材料与方法1.1实验动物：购买30只DBA/1小鼠（雄性，6～8周）。1.2主要试剂和仪器：鸡源性II型胶原蛋白（typeIIcollagen，fromchicksternacartilage，纯度＞99%）购于Chondrex公司；MouseELISAKit（IFN-γ、IL-17、TGF-β）购自于eBioscience公司；Westernblot实验抗体均购自于Cellsignaling公司；不完全弗氏佐剂（IFA）和热灭活结核分枝杆菌（TB）购于DIFCO公司；流式荧光抗体购于BD、eBioscience公司；RPMI1640培养液和胎牛血清均购自于Gibco公司。HCPT：5ml：10mg/支。1.3实验分组将30只DBA-1小鼠分3组：正常对照组、CIA阳性对照组、HCPT治疗组，每组10只。1.4CIA模型诱导及评价：第0天，CIA组和HCPT组每只小鼠给予100μl乳化抗原，于尾根部2～3cm处皮下注射；第21天加强免疫，以CII溶液和等量的IFA乳化后的抗原在小鼠背部两侧皮下注射。HCPT组从第1天至第20天给于HCPT5gm/kg/天,腹腔注射，每日1次；对照组给予相同方法、相同剂量的生理盐水，每日1次。第22天开始观察小鼠发病情况。CIA评分标准如下：0分，无异常表现；1分，不严重踝关节有一定的发红和肿胀，或在个别足趾出现发红和肿胀；2分，踝关节出现中度红斑及肿胀；3分，包括足趾在内的爪子出现严重红斑、水肿；4分，涉及多关节的重度肿胀的肢体。每只小鼠四肢评分之和为关节炎评分。1.5小鼠关节病理改变分析：将小鼠处死后取患病关节，置于10%福尔马林中固定，经脱钙等处理制成石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察病灶炎性细胞浸润程度。1.6CII特异性T细胞增殖实验：收集CIA小鼠脾脏细胞，调整细胞数为5×106/ml，加入不同浓度的CII刺激（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），37℃、5%CO2培养48～56h，每孔加入1μCi的放射性同位素H3-TdR，继续培养至72h，抽膜、洗板、加入闪烁液后读取cpm（微居里）值。1.7小鼠外周淋巴结T细胞亚群检测：在小鼠发病高峰期取淋巴结制备单细胞悬液，加入流式荧光抗体以FITC-anti-CD4、APC-anti-IFN-γ、PE-anti-IL-17通过胞内染色标记Th1、Th17细胞，以APC-anti-CD4、PE-anti-CD25、FITC-anti-Foxp3通过胞内染色标记Treg细胞，检测各群细胞表达水平。1.8细胞因子检测：将脾脏制备的各组单细胞悬液（1×107/ml），体外加入CII（20μg/ml）刺激。于37℃、5%CO2培养箱中培养48h收集上清，ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-17、TGF-β的含量。1.9统计学方法采用Students'ttest、单侧ANOVA检验分析组间差异。P0.05表示具有统计学意，P0.01表示具有高度统计学意义。2结果2.1HCPT处理对小鼠发病的影响：二次免疫后每天观察小鼠发病情况并进行评分，CIA组小鼠发病率为100%，HCPT处理组小鼠发病率明显降低，为57%，CIA组小鼠约在首次免疫27d开始发病，而HCPT处理组发病稍有推迟，关节评分明显低于CIA组，且病情进展较为缓慢，患病高峰期评分远低于CIA组。HCPT处理组小鼠患肢肿胀程度较CIA组轻微。关节切片经HE染色，CIA组小鼠关节软骨存在一定程度的破坏，炎性细胞浸润较为严重，HCPT处理组小鼠关节炎性细胞浸润较少，软骨破坏不明显。在发病后期（首次免疫45～50d左右），小鼠病情虽都有所缓解，但HCPT组关节评分明显低于CIA组，两组评分具有统计学差异（P0.05）(图1）01234562729313335373941434547495153555759DaysPostImmunizationMeanclinicalscoreHCPTCIANomal图1HCPT对CIA鼠发病的抑制作用2.2HCPT处理对CII特异性T细胞增殖能力的影响：通过H3增殖实验检测小鼠脾脏单个核细胞对CII的反应性，结果显示，在CII5μg/ml、10μg/ml及20μg/ml组，HCPT组T细胞增殖均明显低于CIA组（三组的平均值CIA/HCPT比值分别为15.553±0.873/27.05±0.676,18.648±1.172/33.45±1.532，18.349±0.946/30.251±0.935），HCPT处理可显著抑制CII特异性T细胞的增殖（图2），提示HCPT对CIA的疗效可能与其抑制CII特异性T细胞的增殖相关。图2HCPT对CII特异性T细胞亚群增殖能力的影响2.3HCPT处理对小鼠T细胞亚群的影响：图3,4显示，炎症细胞Th1、Th17在CIA组中的表达明显高于正常组(CIA组和正常组Th1、Th17分别为1.808±0.075/0.813±0.073，5.712±0.269/1.561±0.112)，Th17细胞在CD4+T细胞中百分比高达正常组中的3倍，Th1细胞百分比也明显上升。经过HCPT处理后，两群细胞的百分比可下降至约2/3(HCPT组和CIA组Th1、Th17分别为1.055±0.103/1.808±0.075，3.806±0.375/5.712±0.269)，HCPT组与CIA组相比差异具有统计学意义（图3，P0.05）。这些细胞在体外分泌细胞因子的能力由图4所示，相较正常组，CIA组小鼠细胞上清中Treg相关细胞因子TGF-β分泌水平下降明显(CIA组和正常组TGF-β分别为120.5±5.148/330.2±14.853)，经HCPT处理后可出现明显的改善，TGF-β含量明显升高(HCPT和正常组TGF-β分别为299.9±14.828/330.2±14.853)；CIA组小鼠细胞上清中炎症因子IFN-γ、IL-17的含量明显升高(CIA和正常组IFN-γ和IL-17分别为2130.1±231.275/830.4±31.