10第十章发酵过程的检测与自控1已hard.

发酵过程的检测与自控第十章检测的具体目的包括：①了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符；②决定种子罐移种和发酵罐放罐的时间；③对不可测变量进行间接估计；④对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制；⑤通过过程模型实施计算机控制；⑥收集认识和发展过程（包括建立数学模型）所必需的数据。一、概述第一节发酵过程检测检测的方法包括：物理测量：如温度、压力、体积、流量等；物理化学测量：pH、溶O2、溶CO2、氧化还原电位、气相成分等；化学测量：基质、前体、产物等的浓度；生物学和生物化学测量：生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等。这些测量可提供反映环境变化和细胞代谢生理变化的许多重要信息，作为研究和控制发酵过程的基础。一、概述物理参数（如温度、压力、体积、流量、泡沫体积）化学参数（pH、溶O2、溶CO2、氧化还原电位、气相成分等、基质、前体、产物浓度）生物参数（生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分）质谱仪（MS）流动注射分析仪,FIA场流分离（FFF）一、概述世界上唯一一台核磁共振发酵罐：在线观察细胞内蛋白质，核酸的合成一、概述传感器：指能够将非电量转换为电量的器件，作用是感受被测量的变化，并将来自被测对象的各种信号转换成电信号。继而让仪表显示、记录，或传送给电子计算机处理。二、发酵传感器（一）发酵过程对传感器的要求（l）可靠性：这是传感器最重要的特性，它包括物理强度、出现故障的频率及故障发生的方式。（2）准确性：是测量值与已知值或实际值之差的量度，或称之为误差。（3）精确度：测量精确度是重复测量的概率。（4）响应时间：在测量位点，有指示值与真值之间的时间滞后，它由反应滞后与传递滞后所造成。（5）分辨能力：又称识别能力，是指测量中所能分辨的最小变化值。二、发酵传感器（6）灵敏度：对灵敏度有各种描述方式，一般指的是传感器所能反应的最小测量单位。（7）测量范围：是传感器所能感受的最大值与最小值之差。（8）特异性：是传感器只感知被测变量的变化而不受过程中其他变量和周围环境条件变化影响的能力。（9）可维修性：指的是传感器发生故障或失效后进行修理和校准的可能性及难易程度。（10）发酵过程对传感器的特殊要求：耐受蒸汽灭菌、保持无菌、不易污染和便于清洗。（二）发酵用传感器的分类测量操作方式：离线(off-line)在线(on-line)原位(in-line)传感器；检测原理：力敏、热敏、光敏、磁敏、电化学（三）主要在线传感器1.pH传感器pH值传感器是一个密封的银/氯化银混合电极，耐用而稳定。pH探头通过测量pH电极和参比电极、被测溶液所组成的电池的电动势，间接测量pH。pH值的测量范围为0～14。分辨率为0.005pH单位，温度范围:5到80℃。2.溶氧电极一般使用复膜溶氧探头，有两种：原电池型：由碱性电解液、银阴极和铅阳极组成。极谱型：由银阳极、铂阴极、氯化银电解液和极化电源组成。这两种探头，产生的电流都正比于通过膜扩散进入探头的氧量。溶氧电极原理：利用电化学所产生的氧化还原反应，产生电流或电位变化的强弱，来判断溶氧量的多寡(DOT)，其反应式如下：极谱型溶氧电极在阳极4Ag+4Cl-(Br-)→4AgCl(AgBr)+4e-（氧化）在阴极O2+2H2O+4e-→4OH-（还原）极谱电极需要在阴极(Au或Pt)和阳极(Ag或AgCl)之间外加一个负偏压，使氧可以在阴极被还原膜需要耐受灭菌(聚四氟乙烯膜或硅酮膜)搅拌、温度、压力、膜污染的影响可收缩可灭菌溶氧电极校准、冲洗、灭菌或更换电极的状态测量状态3.氧化还原电位装置：复合电极（Pt电极和Ag/AgCl参比电极组成）、具有mV读数的pH计。氧化还原电位随发酵液中氧化成分与还原成分之比的对数而变化。使用情况：溶氧压很低（如厌氧或氧限制发酵），以至超出溶氧探头的测量下限时。氧化还原电位的测量可以弥补这一信息源的缺失。测量状态校准状态CO2通过透气性膜扩散进入到碳酸氢钠水溶液中，扩散速率与跨膜的浓度驱动力成正比，缓冲液的pH会下降，pH电极测出变化指示出溶解CO2浓度的变化碳酸氢钠溶液在高温灭菌时会部分分解，因而每次灭菌后均需校准才能测定4.溶CO2传感器5.温度传感器发酵罐的测温方法有多种，包括玻璃温度计、热电偶、热敏电阻、热电阻温度计等。具有直流输出信号的温度传感器，可用于实现控制，常用的有热电偶(TC)和热敏电阻(RTD)。6.压力传感器灭菌时需要测量压力，可灭菌的压力传感器包括压阻式、电容式、电阻应变计压力传感器等，最常用的是隔膜式压力表。将膜片的信号转换为可测信号：压电现象；可变电阻。6.压力传感器工作原理CYY系列应变式压力传感器采用周边固定的不锈钢园平膜片为敏感元件，精密箔式组合电阻应变计为转换元件，通过电子束焊接，使膜片与引压管成为一体。粘贴在膜片上的电阻应变计组成全桥电路，在压力作用下，膜片产生变形，应变计感受其应变后，它的电阻值发生相应变化，从而使电桥失去平衡并输出与作用压力大小成正比的电讯号。7.离子选择性电极离子选择性电极可用于离线检测发酵液中特定的无机离子，如NH4+、Ca2+、SO42-等。电极以类似pH电极的方式工作，与标准参比电极组合使用。7.离子选择性电极是利用膜电势测定溶液中离子的活度或浓度的电化学传感器。当它和含被测离子的溶液接触时，在它的敏感膜和溶液的相界面上产生与该离子活度直接有关的膜电势。离子选择性电极不同于经典的电极，前者的膜电势是由电极膜表面的离子交换平衡产生的，而后者的电极电势是氧化还原电势。电极A|溶液(1)|膜|溶液(2)|电极B(A电极电势)(膜电势)(B电极电势)其中膜电势是膜两边溶液(1)和溶液(2)之间的相间电势差。设A、B电极为同一可逆参比电极(如饱和甘贡电极),两个溶液的溶质为同一种电解质,但浓度不同。上述原电池就成为一浓差电池。离子选择电极依所用膜材料不同可以分成玻璃膜电极、固体膜电极、液体离子交换膜电极、天然载体液膜电极、气体敏感膜电极和离子选择场效应管离子选择性电极是一个半电池（气敏电极例外），它的电势不能单独测量，而必须和适合的外参比电极组成完整的电化学电池，然后测量电池的电动势8.光密度传感器基于对光的透射、反射或散射而实现测定。细菌(可见光)；较大的微生物(红外波长)；植物细胞或昆虫(浊度法)。光源常采用绿色滤光器、红外二极管、激光二极管或780～900nm的激光。9.泡沫电极一般通过控制给料来添加消泡剂，这时就需要一些泡沫检测装置。电容传感器、电导电极、热导泡沫电极、超声波(泡沫吸收25-40kHz)、转盘传感器泡沫高度的检测常用电极探头和声波法测定。10.生物传感器生物传感器是利用生物催化剂（生物细胞或酶）和适当的转换元件制成的传感器。用于生物传感器的生物材料包括固定化酶、微生物、抗原抗体、生物体组织或器官等。用于产生二次响应的转换元件包括电化学电极、热敏电阻、离子敏感场效应管、光纤和压电晶体等。酶电极即酶传感器，主要由固定化酶膜与相应的各类电化学元件构成。酶需经过固定化处理。所用酶可以是一种酶或复合酶，或是酶和辅酶系统。10.生物传感器酶膜测定对象电流电势微生物电极10.生物传感器生物传感器的在线使用的局限性1.主要是灭菌和稳定性方面存在问题。2.生物传感器自身同样会受到影响发酵的因素的影响。3.另外，生物传感器中常需在检测器上固定微生物细胞或酶层，或具有另外的膜层，这会增加传质阻力，延长响应时间在发酵过程检测中，除了使用上述传感器外，还引入了其他一些现代分析技术，其中最重要的是生物量、尾气成分和发酵液成分检测。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术目前还不具备理想的在线传感器，即使是离线分析，结果也不尽人满意。（l）干细胞浓度：培养基不含固形物，可得到重现结果。（2）DNA含量：DNA折算生物量。费事，应用很少。（3）沉降量或压缩细胞体积：如果培养基不含固形物，则有一定应用价值。（4）粘度：指示丝状菌的生长和自溶，而与生物量不直接相关。（5）浊度：光密度（OD）与细胞浓度成线性关系。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（一）生物量分析（6）过滤探头：发酵液的过滤特性和细胞浓度及形态相关。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（一）生物量分析过滤探头可自动测定达到预先设定的滤饼体积Vc和所获得的滤液体积Vf及所需的过滤时间tf，并由此估算出细胞浓度。（7）发酵液的荧光检测①荧光探头；②在线采样的方式：无菌取样后进行荧光测定。细胞内呼吸链上的NADH在360nm处可激发出能在460nm处检出的特征性荧光，利用这一荧光反应可以定量分析细胞活性或细胞浓度。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（一）生物量分析（1）红外CO2分析仪：两条相同的入射红外光束分别通过气样室和参比室，在气样室内由于CO2对光吸收而发生衰减，根据检测的衰减程度可确定气样中的CO2浓度。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（二）尾气分析2.6~2.9μm和4.1~4.5μm（2）顺磁O2分析仪：氧的顺磁特性使磁场发生变化，迫使哑铃偏转，转矩与磁场力平衡，因而可根据偏转位置确定气体中氧的含量。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（二）尾气分析顺磁O2分析仪测量原理氧分子在磁场中有很强的顺磁性。可以利用氧分子会被强磁场所吸引的特性来检测氧，磁氧传感器是由一对悬垂于一个非均匀的磁场中对称的哑铃球组成，当环境气体中有氧气时，磁场中氧分子很强的顺磁性会推动哑铃球在磁场中发生偏转。一束打到哑铃球相连镜面上的光不对称地被反射到2个光敏元件上，产生一个电压变化。此压差产生一电流使哑铃回复到原位。该电流值对应氧浓度，可将氧的体积百分含量线性地在显示屏上显示。（3）质谱仪（MS）：样气经毛细管和分子漏进入成离子区，由电子束将其离子化，形成的离子被永久磁铁排斥和加速进入磁扇形分析器后，按质量／电荷比分离，被一排杯形法拉弟捕集器分别接收，由电子放大器检测。第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（二）尾气分析高效液相色谱（HPLC）具有分辨率高、灵敏度好、测量范围广、快速及系统特异性等优点，目前已成为实验室分析的主导方法。流动注射分析（FIA）系统第一节发酵过程检测三、发酵过程其他重要检测技术（三）发酵液成分分析一般，物理传感器（如温度）相当可靠的；物理化学传感器（如pH、DOT）须加倍小心；生化和生物传感器不可靠。第一节发酵过程检测四、发酵过程检测的可靠性（一）各种传感器和仪器的可靠性（1）校准：传感器和分析仪在使用一段时间后应当进行校准。（2）数据解析：利用相关变量的检测数据进行解析，确认某些传感器的可靠性。（3）噪声分析：所有传感器和分析仪都不可避免地会出现一些噪声。噪声突然或缓慢消失，有可能是出现故障的信号。第一节发酵过程检测四、发酵过程检测的可靠性（二）分析数据的确认第二节发酵过程变量的间接估计一、与基质消耗有关变量的估计二、与呼吸有关变量的估计三、与传质有关变量的估计四、与细胞生长有关变量的估计(一)基质消耗率（以补料分批发酵为例）第二节发酵过程变量的间接估计一、与基质消耗有关变量的估计如发酵达到准稳定状态，即ds／dt=0，s保持不变，而sr又为常数，那么，通过对补料体积流速F和发酵液体积V的在线测量，便可在线估计基质消耗率Rs。(二)基质消耗总量第二节发酵过程变量的间接估计一、与基质消耗有关变量的估计(一)CO2释放率第二节发酵过程变量的间接估计二、与呼吸有关变量的估计(二)氧消耗率第二节发酵过程变量的间接估计二、与呼吸有关变量的估计(三)呼吸商CO2释放率与氧消耗率之商叫做呼吸商。第二节发酵过程变量的间接估计二、与呼吸有关变量的估计(一)液相体积氧传递系数发酵过程中的氧传递量与氧消耗量达到平衡时三、与传质有关变量的估计对于大型发酵罐，则溶氧浓度差应取对数平均值氧消耗率(二)溶氧浓度（CL）溶氧传感器测量的不是溶氧浓度，而是溶氧压（DOT）。三、与传质有关变量的估计(一)生物量