11级四次分生作业(蓝色11年考题)

1《分子生物学》作业一第2-4章/第8章1.什么是SNP？试述研究SNP的意义。全称SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因组DNA上单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人类可遗传变异中最常见的一种.。SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究：1）、SNP数量多，分布广泛。2）、SNP适于快速、规模化筛查。3）、SNP等位基因频率的容易估计。4）、易于基因分型。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP的深入研究具有以下几方面意义：（1）由于SNP的低突变率、高密度、易于检测的特性，使得它在遗传学分析中得到广泛应用；（2）SNP具有已知性、可遗传性、可检测性，研究SNP可用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。寻找疾病相关的突变位点，发展疾病预防策略，（3）研究SNP本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性，从而个性化医疗。通过对药物靶点个体差异性分析，个性化药物、方法治疗。（4）法医学研究。法医检验中可以用DNA芯片分析SNP位点，应用于亲权鉴定等；(5)器官移植中供体/受体配对分析。对SNP的研究将有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病特别是对负责疾病如肿瘤、某些遗传疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等的易感性和疾病的关联基因，此外还在法医学和致病基因的搜寻中发挥重大作用。2.ORF开放阅读框架(openreadingframe，ORF)：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码序列。3.调节基因指一段有效地DNA片段，他通过转录、翻译而产生调节蛋白，该蛋白与操纵基因相互作用，从而对操纵子的活动进行控制。4.请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。蛋白质组学常用的研究方法有双向凝胶电泳和质谱技术，基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程。（1）样品制备—样品来源于细胞、组织、体液等。也可采用全蛋白或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜蛋白、核蛋白等）以提高低丰度蛋白质的上样量及检测灵敏度。应注意尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分辨率。（2）样品分离—双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。第一向：等电聚焦IEF第二向：SDS-PAGE。（3）染色方法考马斯亮蓝染色、银染（不含戊二醛）、荧光染色（Cy3、Cy5），放射性同位素标记等。5.简述酵母双杂交技术的原理。答：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（BD）与转录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。26.分子克隆技术包括哪些基本步骤？目的基因和载体连接主要有哪些方法？基本步骤一、目的基因的获取二、载体的选择三、目的基因和载体的酶切与连接四、重组DNA导入受体细胞五、重组体的筛选和鉴定目的基因和载体连接方法主要有(一)粘性末端连接，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点；(二)平末端连接，质粒和目的基因上没有相同单或双酶切位点，人工接头，通过同聚尾连接；用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；（三）先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。7.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。限制性核酸内切酶的主要用途1）在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。2）分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传病的诊断，法医DNA指纹分析等。3）用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源性分析等。DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段:Klenow片段的主要功能有：1)补齐双链DNA的3'末端，同时可使3'末端DNA标记同位素；2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；3)DNA序列分析。2、TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。3、逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆转录作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。4、末端脱氧核糖核苷酰转移酶功能主要有：1)在载体或目的基因3'末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。2)用于DNA3'末端的同位素探针标记。DNA连接酶（DNAligase）在DNA重组中的主要功能是催化两个DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成3’,5’磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。碱性磷酸酶：作用是催化除去DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基团，其主要用途有出去DNA片段上的5'磷酸，以防自身连接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前出去RNA或DNA上端的5'磷酸。核酸酶S1:可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分，其作用是出去双链DNA的粘性末端以产生平末端、出去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的颈环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。38.举例说明载体应具备的基本要素以及双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。(1)载体应具有以下特征①能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的相对分子量，一般应10kb;②带有遗传筛选标记；③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。（2）双抗生素筛选原理：某些质粒载体如pBR322质粒中装有Ampr和Tetr抗性基因，在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素对照筛选。(3)Blue/whitescreen:蓝白斑筛选。即β-半乳糖苷酶基因失活筛选。其原理是：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ’基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α－肽的DNA片断，IPTG可诱导此片断合成，此片断能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α－互补，形成完整的β－半乳糖苷酶。该酶能催化指使剂底物X－gal形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ’基因中MCS(多克隆位点)，lacα－肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β－半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。9.有哪些常用的探针标记物？如何进行探针的标记？放射性同位素标记:常用标记探针的同位素:32P：β，半衰期短（14.3d），标记核苷三磷酸，灵敏度很高，分辨率不高。35S：β，标记蛋氨酸或取代核苷酸α位磷酸基中的氧，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。3H：β，半衰期长（4417d），使用较少。125I：γ，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，原位杂交。同位素标记方法1.缺口平移法（双链）2．随机引物法（单链）3.DNA探针的末端标记4．PCR标记DNA探针5．单向体外转录制备RNA探针非放射性标记1）.酶标记核酸探针辣根过氧化物酶（HRP）易进入细胞内部，便宜，易观察，应用最广泛。常用标记方法是戊二醛交联法和过碘酸钠法2）．生物素（biotin）标记核酸探针应用广泛，可替代同位素标记。用链亲和素系统检测。酶促标记法操作复杂，价格昂贵。光敏生物素（photobiotin）标记方法简单，价格适宜。地高辛（DIG）：标记于dUTP上，通过随机引物或缺口平移法引入DNA分子中。可长期保存，不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物反差好，背景染色低。广泛应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交尤其是原位杂交。荧光素（fluorescein）：标记方法有直接法和间接法。非放射性标记方法1.化学修饰法：简单、成本低、较通用。2.酶促反应标记法：灵敏度高，过程较复杂，成本较高。10.影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？影响核酸分子杂交的因素：（1）温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢；复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的。（2）DNA浓度：DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”，“成核”速度与DNA浓度的平方成正比；溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。（3）DNA分子大小和复杂度：DNA分子越大，复性速率越慢；DNA分子越复杂，复性速率也越慢。（4）离子强度对：增加盐浓度可加快互补链合成双链的速度，盐中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥。优化方法：4探针的选择:检测靶单个碱基改变选用寡核苷酸探针；在检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体；100bp左右的探针适合原位杂交。探针的标记方法:在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。探针的浓度:随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加；膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml；原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。杂交最适温度:杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少；最适复性温度比Tm低25℃。一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。反应时间和洗膜温度杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右；杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行。作业二生物分子的分离纯化聚合酶链反应PCR一、名解荧光光度法：利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为荧光光度法。酚抽提法：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。比活：单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性;（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示）凝胶过滤层析：凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。巢式PCR:巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引